黃連阿膠湯對失眠大鼠血清Th1/Th2平衡的影響

，敏捷

(福建中醫藥大學，福州 350122)

黃連阿膠湯對失眠大鼠血清Th1/Th2平衡的影響

陳建，陳敏捷

(福建中醫藥大學，福州 350122)

目的 觀察黃連阿膠湯對失眠模型大鼠Th1/Th2平衡的影響。方法 將36只SD大鼠隨機分為3組,PCPA法復制失眠大鼠模型,ELISA法檢測大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4的水平。結果 模型組大鼠IFN-γ、IL-1β的水平明顯下降(P<0.01)，IL-4、IL-10的表達則明顯升高(P<0.01)，IFN-γ/IL-4比值降低(P<0.01)；黃連阿膠湯組IFN-γ、IL-1β的表達有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10的表達降低(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高(P<0.01)。結論 黃連阿膠湯能提高失眠大鼠Th1細胞因子的表達，降低Th2細胞因子的表達，促進Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，是其治療失眠的可能機制之一。

黃連阿膠湯；失眠；細胞因子；Th1/Th2平衡

失眠是臨床常見的疾病，其發病機制較為復雜。近年來研究表明睡眠與免疫系統之間密切相關,Th1/Th2細胞平衡的偏移對睡眠產生一定的影響。黃連阿膠湯為《傷寒論》治療少陰病“心中煩不得臥”的代表方，筆者在臨床以其加減治療失眠取得了較好的效果，為了進一步探索其作用機制,觀察了黃連阿膠湯對失眠大鼠血清Th1細胞因子IFN-γ、IL-1β及Th2細胞因子IL-4、IL-10水平的影響，通過分析Th1/Th2平衡的偏移情況,從免疫學方面闡釋其治療失眠的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物及制備 對氯苯丙氨酸(PCPA)(美國Sigma公司，批號:SHBC0245V)；黃連阿膠湯由黃連、黃芩、白芍、阿膠、雞子黃組成，各藥材均購自福建中醫藥大學國醫堂，并經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為正品。

1.1.2 試劑 水合氯醛(上海強順化學試劑有限公司，批號：20120405)；大鼠IFN-γ ELISA試劑盒(RD公司，批號：20131001A)；大鼠IL-4 ELISA試劑盒(RD公司，批號：20131001A)；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(RD公司，批號：20131001A)；大鼠IL-10 ELISA試劑盒(RD公司，批號：20131001A)。

1.1.3 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠36只，體質量180～200 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.1.4 主要儀器 低溫高速離心機、DNP-9082型電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)、ELx50全自動酶標洗板機(美國寶特)、TECAN M200全自動酶標儀(奧地利)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 大鼠購進后，自由飲食攝水，自然光照，適應性飼養1周,隨機分為3組，每組12只，即空白對照組、模型對照組、黃連阿膠湯組。

1.2.2 造模 對氯苯丙氨酸(PCPA)以弱堿性生理鹽水(pH 7～8)配置成45 mg/mL混懸液備用。模型對照組、黃連阿膠湯組大鼠每日上午腹腔注射PCPA混懸液1 mL/100 g，空白對照組大鼠腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水，連續注射2 d。實驗中觀察到第1次腹腔注射PCPA混懸液30 h后大鼠出現晝夜節律消失，白天活動頻繁，與空白對照組有明顯不同，說明模型復制成功。

1.2.3 給藥 黃連阿膠湯各藥按原方用量比例縮小5倍,即50 g相當于3 g，將除雞子黃以外的各藥加適量的水浸泡1 h，煮沸30 min過濾, 將濾渣再加適量水煎煮10 min后，合并2次濾液，加入阿膠烊化，然后納入雞子黃攪拌均勻,濃縮至每毫升煎液相當于原藥材1.03 g，4 ℃冰箱保存備用。每組動物于每日上午9：30左右灌胃，以成人(按60 kg算)每公斤體質量的6倍給藥，即正常對照組與模型對照組分別用生理鹽水灌胃1.03 g/(kg·d)，中藥組用黃連阿膠湯煎液灌胃1.03 g/(kg·d)，1次/d,連續7 d。

1.2.4 樣品采集與處理 各組大鼠最后1次給藥24 h后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，立即腹主動脈采血5 mL，靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-80 ℃冷凍保存。采用ELISA法嚴格按試劑盒說明對IFN-γ、IL-4、IL-1β、IL-10的水平進行檢測。

2 結果

2.1 一般情況 PCPA腹腔注射30 h后，大鼠興奮性增高，煩躁不安，活動頻繁，攻擊性增強，對外界的聲光刺激較為敏感，晝夜規律基本被破壞，說明失眠模型復制成功。

2.2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4比較 大鼠造模后血清IFN-γ含量明顯降低，與空白組比較有統計學意義(P<0.01);黃連阿膠湯組大鼠血清IFN-γ表達升高，與模型組比較有統計學意義(P<0.05)。與空白組比較,模型組大鼠血清IL-1β含量明顯降低，有統計學意義(P<0.01)；黃連阿膠湯組大鼠血清IL-1β含量較模型組明顯升高，有統計學意義(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-4含量升高，有統計學意義(P<0.01)；黃連阿膠湯組大鼠血清IL-4含量較模型組降低，有統計學意義(P<0.05)。模型組大鼠血清IL-10含量較空白組明顯升高，有統計學意義(P<0.01)；黃連阿膠湯組大鼠血清IL-10含量較模型組降低，其差異有統計學意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清IFN-γ/IL-4比值降低,有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較,黃連阿膠湯組大鼠血清IFN-γ/IL-4比值升高，有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4比較

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

失眠屬祖國醫學“不寐”“目不瞑”“不得眠”等病的范疇，總與陽不交陰，陰陽不和有關，此即“治病求本，本于陰陽”之謂。對于失眠的認識雖肇端于《黃帝內經》，但對失眠的辨證論治則始自于《傷寒論》。《傷寒論》所載之黃連阿膠湯原為治療少陰熱化“心中煩不得臥”的代表方，方中黃連、黃芩定瀉心火，抑亢陽；芍藥、雞子黃、阿膠補真陰，諸藥相合則抑陽而交陰，使陰陽相交，與失眠之陽不入陰，陰陽不和的病機絲絲入扣。臨床以之加減治療失眠，取得了良好的效果。 從現代研究來看，失眠的發病機制非常復雜，涉及到中樞神經系統眾多的神經網絡和一系列神經介質、神經內分泌和神經調節物質。近來研究表明，睡眠與免疫系統之間存在密切的聯系,Th1/Th2細胞因子動態平衡對睡眠起著重要的調節作用。人類Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-1β、TNF-β等細胞因子，其中以IFN-γ為代表；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，其中以IL-4為代表[2]。IFN-γ與IL-4的比值即IFN-γ/IL-4可反映Th1/Th2的偏移情況，常作為研究Th1/Th2失衡的主要指標[3]。在正常情況下Th1與Th2細胞通過分泌細胞因子進行相互調節與抑制，從而維持機體平衡。當Th1細胞因子表達增加，即Th1/Th2細胞因子平衡向Th1方向偏移時則睡眠增加。動物實驗也表明增加動物腦內或血漿中IL-1β、IFNγ及TNFα可增加SWS睡眠,而降低腦內中上述細胞細子則減少SWS睡眠。Th1細胞細子促進睡眠的作用可能與核轉錄因子(NF-κB)信號通路的激活有關,IL-1β、IFNγ、TNFα都有強烈激活NF-κB的作用，NF-κB激活后氧化亞氮合成酶活性提高，腦組織中NO水平增高,從而促進NREM睡眠。NF-κB激活后還可增加IL-12、COX-2的表達，IL-12是獨立調節睡眠的免疫細胞因子[4],而COX-2催化產生的PDG2則可直接促進NREM睡眠。Th2細胞因子表達增加,即Th1/Th2細胞因子平衡向Th2方向偏移時則有抑制睡眠的作用，其作用機制主要是通過抑制NF-κB的活化,通過NF-κB信號通路影響SWS睡眠。近年來，學者[5-7]開始關注Th1/Th2細胞因子失衡對失眠的影響，研究[8]表明，失眠患者IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4比值降低，Th1/Th2細胞因子平衡向Th2方向漂移，可能是失眠發生的免疫學機制。

筆者前期在臨床上用黃連阿膠湯加減治療失眠，取得了良好的效果，此次實驗以公認的PCPA法復制失眠大鼠模型[9]，觀察了黃連阿膠湯對失眠大鼠Th1/Th2細胞因子表達的影響，試圖從免疫學角度揭示其治療失眠的可能機制。從實驗結果來看,模型組大鼠IFN-γ、IL-1β的水平明顯的下降，IL-4、IL-10的表達則明顯的升高,IFN-γ/IL-4比值降低，Th1/Th2細胞因子平衡向Th2占主導的方向偏移；黃連阿膠湯組IFN-γ、IL-1β的表達有不同程度的升高，IL-4、IL-10的表達降低,IFN-γ/IL-4比值升高，Th1/Th2細胞因子平衡向Th1占主導的方向偏移。由此可見，黃連阿膠湯能夠促進失眠大鼠血清Th1細胞因子的表達，降低Th2細胞因子的表達，從而使Th1/Th2平衡向Th1方向漂移而達到治療失眠的作用,這可能是黃連阿膠湯治療失眠的免疫學機制之一。

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EffectsofHuanglianEjiaoDecoctiononserumTh1/Th2balanceofinsomniarats

CHEN Jian,CHEN Minjie

(Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China)

ObjectiveTo observe the effect ofHuanglianEjiaoDecoctionon serum Th1/Th2 balance of insomnia rats.Methods36 SD rats were randomly divided into 3 groups.The model of insomnia rats was established by PCPA method.The level of IFN-γ,IL-1β,IL-4,IL-10 and IFN-γ/IL-4 in rats serum were determined with enzyme linked immunosordent assa (ELISA) method at the end of the experiment.ResultsThe level of IFN-γ,IL-1β reduced obviously (P<0.01,the expression of IL-4 and IL-10 obviously increased(P<0.01,and the ratio of IFN-γ/IL-4 decreased in the model group;The expression of IFN-γ,IL-1β increased in different degrees(P<0.5,P<0.01),the expression of IL-4,IL-10 reduced(P<0.05),the ratio of IFN-γ/IL-4 increased(P<0.01) inHuanglianEjiaoDecoctiongroup.ConclusionHuanglianEjiaoDecoctioncan increase the expression of serum Th1 cytokines and decrease the expression of serum Th2 cytokines in insomnia rats.The possible mechanism ofHuanglianEjiaoDecoctionin the treatment of insomnia may be achieved by promoting the balance of the Th1/Th2 move to Th1 direction.

HuanglianEjiaoDecoction;insomnia;cytokine;Th1/Th2 balance

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.007

福建省教育廳A類科技項目(JA11136)。

陳 建(1974-)，男，醫學博士，副教授，碩士研究生導師。研究方向：經方辨治情志疾病研究。

R285.5

：A

：2095-6258(2014)05-0779-03

2014-05-07)