復方多西環(huán)素緩釋凝膠對實驗性牙周炎齦溝液IL-4和TNF-α的影響

程鳳峽 田華 吳永生 王志潔 鄭瑤

·論著·

復方多西環(huán)素緩釋凝膠對實驗性牙周炎齦溝液IL-4和TNF-α的影響

程鳳峽 田華 吳永生 王志潔 鄭瑤

目的研究復方多西環(huán)素緩釋凝膠對實驗性牙周炎大鼠牙齦指數(shù)(GI)、牙周袋深度(PD)、附著喪失程度(AL)及齦溝液中白介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。方法選用Wister大鼠42只，隨機分為3組：正常對照組(N組)，陽性對照組(C組)和實驗組(T組)，每組14只。C組和T組建立牙周炎模型后，C組給米諾環(huán)素軟膏治療，T組給復方多西環(huán)素緩釋凝膠治療，均為每周上藥1次共4次，并分別在治療前和治療后記錄GI、PD、AL及齦溝液中IL-4和TNF-α水平。結(jié)果治療后，C組和T組GI、PD、AL均較治療前顯著下降(P<0.05)。牙周炎大鼠齦溝液中IL-4水平顯著低于正常組(P<0.05)，治療后顯著增高(P<0.05)，且T組明顯高于C組(P<0.05)；牙周炎大鼠齦溝液中TNF-α水平顯著高于正常組(P<0.05)，治療后顯著降低(P<0.05)，T組和C組治療后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論復方多西環(huán)素緩釋凝膠能明顯改善牙周炎臨床癥狀，顯著降低齦溝液中TNF-α水平，提高齦溝液中IL-4水平。

緩釋凝膠；多西環(huán)素；骨碎補；齦溝液；白介素-4；腫瘤壞死因子-α

牙周炎是菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因。牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物引發(fā)的宿主免疫和炎性反應是造成牙周組織破壞的主要原因[1]。對于調(diào)節(jié)宿主防御功能的治療方法研究者們有許多嘗試，但多集中于西藥或中藥的全身應用，這在很大程度上限制了研究結(jié)果的臨床應用。復方多西環(huán)素緩釋凝膠是我院自己研制的牙周炎局部緩釋制劑，主要有效成分是鹽酸多西環(huán)素和骨碎補。本實驗將其應用于大鼠的實驗性牙周炎，比較治療前后臨床癥狀和齦溝液內(nèi)一些局部組織免疫產(chǎn)物的濃度，評估其對于宿主牙周炎牙周組織的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備 梅特勒AG-254電子分析天平，ALISEI全自動酶標儀，SANYO MDF-382低溫冰箱，Hettich RS-28型低溫離心機，多西環(huán)素(華北制藥集團)，1-甲基-2-吡咯烷酮(1MP)、三乙酸甘油酯(GAT) 由北京奇松生物科技有限公司提供，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)由長春圣博瑪生物材料有限公司提供，派力奧軟膏(日本新時代制藥株式會社)。

1.2 復方多西環(huán)素緩釋凝膠制備 骨碎補煎煮、過濾，濃縮、醇沉，配制成質(zhì)量濃度為每毫升含1 g生藥的骨碎補提取液。精密稱取骨碎補提取液20 mg，用約100 mg混合溶劑(1MP∶GAT=7∶3)溶解，再取PLGA75∶25計600 mg，用混合溶劑1 g溶解，待完全溶解后，倒入含有骨碎補的試管中，加入多西環(huán)素原料200 mg，最后加入混合溶劑至2 g，漩渦震蕩，分裝，4℃避光保存。

1.3 實驗動物與分組 選用純種Wister大鼠，雌雄各21只，體重(250±10)g。隨機分為3組，每組14只。正常對照組(N組)：不做任何處理；陽性對照組(C組)：米諾環(huán)素軟膏(派力奧)治療組；實驗組(T組)：復方多西環(huán)素緩釋凝膠治療組。

1.4 實驗方法 實驗動物適應性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg麻醉，C組和T組大鼠用直徑為0.2 mm的正畸鋼絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙，結(jié)扎絲盡量放入齦溝內(nèi)。自結(jié)扎日起動物給予高糖喂養(yǎng)，8周后每組隨機取1只大鼠，麻醉下觀察第一磨牙牙周組織變化，探診牙周袋，處死動物后制作右上頜第一磨牙牙體牙周聯(lián)合切片。成模標準為組織學觀察：結(jié)合上皮向根方增殖，固有層結(jié)締組織炎性細胞浸潤，牙周膜纖維排列紊亂，牙槽骨吸收，可見骨陷窩。牙周炎模型鑒定成功后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg麻醉，C組牙周袋內(nèi)注入鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派麗奧軟膏，新時代株式會社)，T組給牙周袋內(nèi)注射復方多西環(huán)素緩釋凝膠，均至齦緣有藥物溢出；每周1次，重復4次。在第1次上藥前(治療前)和最后1次上藥后1周(治療后)，記錄3組指標。所有臨床指標數(shù)據(jù)均由同一位不了解分組情況的牙周醫(yī)生測定。

1.5 齦溝液IL-4和TNF-α含量測定 大鼠麻醉后雙側(cè)上頜第一磨牙牙面擦干隔濕，用3個已稱量的whatman濾紙條(2 mm×10 mm)插入取樣牙的頰側(cè)近中、中央及遠中3個位點的牙周袋內(nèi)，直至遇輕微阻力為止，30 s后取出合并放入一個Ep管中(若有血液和唾液污染，則棄置不用)。用電子分析天平分別稱量齦溝液提取前濾紙條和Ep管的重量及其提取齦溝液后的重量，兩者相減即得齦溝液的重量，按1 mg/ml換算成體積。Ep管中加入PBS緩沖液200 μl，-70℃保存。檢驗時室溫解凍，4℃離心10 min(1 000 r/min)，取上清液備用。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書(試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司)提供的操作方法，測定齦溝液內(nèi)IL-4和TNF-α含量。

1.6 牙周臨床指標的測定

1.6.1 牙齦指數(shù)(GI)[1]：將牙周探針沿齦緣輕輕滑動，觀察有無出血。0=正常牙齦；1=輕度炎癥: 輕度顏色改變，輕度水腫；2=中度炎癥：色紅，水腫，探診出血；3=重度炎癥：明顯發(fā)紅，水腫，紅腫明顯或有潰瘍，有自發(fā)出血傾向。

1.6.2 牙周袋深度(PD)：用牙周探針(Nordent SST,USA)測量近中頰、頰側(cè)、遠中頰3個點牙周袋深度，取均值。

1.6.3 附著喪失程度(AL)：測量牙周袋深度后，當探針尖沿牙根面退出時，探尋釉牙骨質(zhì)界位置，測得釉牙骨質(zhì)界到齦緣的距離，將袋深度減去該距離即為附著喪失的程度。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

治療前C組和T組的各項數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與N組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后，C組和T組GI、PD、AL和TNF-α均較治療前顯著下降(P<0.05)，IL-4有顯著上升(P<0.05)。治療后T組和C組比較，GI和TNF-α差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而PD、AL和IL-4的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，T組的改善更為明顯(P<0.05)。見表1、2。

表1 3組治療前后牙齦指數(shù)、牙周袋深度和附著喪失變化

表2 3組齦溝液中IL-4和TNF-α水平

注：與N組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

3 討論

牙周袋內(nèi)緩釋藥物逐漸成為牙周病藥物治療的發(fā)展趨勢。牙周局部緩釋用藥的理想標準包括：(1)對牙周致病菌有較強的殺滅或抑制作用；(2)藥物可持續(xù)釋放較長時間發(fā)揮作用，減少不良反應；(3)可促進牙周組織再生；(4)減少上藥頻率，提高患者依從性；(5)藥物可貼附在牙周袋中不易脫落，無不適；(6)緩釋載體有良好的生物相容性，無刺激，可生物降解；(7)劑型便于臨床操作，能深入牙周袋底及根分叉處等；但目前臨床尚沒有一種制劑能滿足這些要求[2，3]。

本研究緩釋凝膠中治療藥物多西環(huán)素和骨碎補提取液在牙周治療中具有抑菌、抗膠原酶、促進成纖維細胞的成骨分化及在牙面附著等多重作用；PLGA作為緩釋輔料使藥物進入牙周袋變成膜狀，不但能明顯延長藥物釋放時間，還可以阻擋牙齦上皮向牙周袋內(nèi)生長，且具有良好的生物相容性，可降解，已被FDA正式批準為藥用輔料[4]；1-甲基-2-吡咯烷酮作為溶劑，三乙酸甘油酯作為增塑劑，均有良好的生物降解性能，對凝膠最終的物理性狀起到重要作用，滿足了牙周局部凝膠應用方便，可深入牙周袋底部及根分叉區(qū)，藥物緩慢釋放，不易脫落，異物感小等要求。

牙周炎的發(fā)病過程與Th1/Th2免疫應答平衡的失調(diào)有密切關(guān)系，Th1型細胞因子可加重牙周組織的炎癥和增加牙槽骨的破壞程度，Th2型細胞因子可有效減輕牙周組織的病變程度，對牙周組織具有保護作用[5]。齦溝液是來源于牙周結(jié)締組織的滲出液，牙周組織對局部刺激的免疫反應、炎癥情況以及牙周組織修復情況都可能會改變齦溝液的量及成分。

TNF-α是一種單核細胞來源的Thl型炎性因子，在牙周炎損害起重要作用，包括刺激成纖維細胞產(chǎn)生膠原酶，導致結(jié)締組織的破壞和骨吸收，刺激基質(zhì)細胞的凋亡從而限制牙周組織的修復，抑制成骨，提高中性粒細胞的吞噬功能促進中性粒細胞脫顆粒和分泌過氧化物酶，誘導多種細胞因子如IL-1、IL-6和IL-8等的產(chǎn)生從而啟動炎性反應[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎和牙齦炎患者齦溝液中的TNF-α水平高于健康者，慢性牙周炎患者齦溝液中TNFα水平與牙槽骨吸收活性呈正相關(guān)，通過治療，齦溝液中的TNFα水平明顯降低[8，9]。

IL-4是主要由活化的T細胞、單核細胞分泌的具有多種生物學功能的細胞因子，在促進以Th2細胞為特征的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。IL-4被認為可以通過下調(diào)巨噬細胞功能的作用及誘使單核細胞凋亡，抑制促炎因子IL-6、IL-1、TNF-α和PGE2，促進IL-l受體拮抗劑(IL-lra)的產(chǎn)生；有研究認為牙周炎組織中IL-4缺乏，在嚴重的牙周炎位點齦溝液中不能檢測到IL-4，基礎治療癥狀緩解后，在相同位點的GCF中可檢測到IL-4的存在[10，11]；而也有學者報道基礎治療控制炎癥后，IL-4水平雖有升高但與治療前無顯著差異，認為這可能是因為宿主本身IL-4缺乏導致了易感人群的牙齦炎發(fā)展成了牙周炎[12，13]。

根據(jù)中醫(yī)的理論，腎虛是牙周病發(fā)病的主要因素，腎主骨生髓，齒為骨之余，腎虛則齒衰，腎固則齒堅。楊霞等用益氣滋腎合劑治療大鼠實驗性牙周炎發(fā)現(xiàn)治療后牙齒的松動度有明顯改善，外周血中TNF-α和IL-1β水平顯著降低，牙槽骨的密度有一定程度的增加[14]。補腎合劑可以降低實驗性牙周炎大鼠外周血中TNF-α的表達水平，改善牙周菌群和牙周狀況[15，16]。許彥枝等[17]在牙周袋內(nèi)應用雙黃補緩釋藥條(主要成分為黃連、黃芩、骨碎補)治療慢性牙周炎發(fā)現(xiàn)治療后牙周指標明顯改善，齦溝液中的LDH、ALP和AST水平均有明顯下降。謝雁鳴等[18]研究證實骨碎補能抑制IL-6、TNF-α釋放和促進IL-4分泌的作用。

多西環(huán)素不僅對多種牙周可疑致病菌有很強的抑菌作用，還能通過多種途徑發(fā)揮宿主免疫調(diào)節(jié)作用。多西環(huán)素通過與膠原酶活化所必需的金屬離子螯合，抑制膠原酶的產(chǎn)生和分泌，減輕局部組織破壞。Golub等[19]還報道了多西環(huán)素可以直接抑制牙周炎組織中中性粒細胞來源的基質(zhì)金屬蛋白酶活性。

本實驗結(jié)果表明，大鼠實驗性牙周炎齦溝液中IL-4顯著低于正常組，TNF-α顯著高于正常。復方多西環(huán)素緩釋凝膠治療4周后，GI、PD和AL等臨床指標得到明顯改善，且實驗組PD和AL的改善較米諾環(huán)素膏組更為明顯。T組治療后齦溝液內(nèi)TNF-α水平顯著降低，IL-4水平顯著增高，且較米諾環(huán)素膏組增高顯著。這些結(jié)果表明復方多西環(huán)素緩釋凝膠通過多西環(huán)素和骨碎補的多種作用途徑減輕了牙周局部炎癥、結(jié)締組織附著的喪失及牙槽骨吸收，這可能尚不能說明復方多西環(huán)素緩釋凝膠的應用調(diào)節(jié)了局部牙周組織的Th1/Th2免疫應答平衡，但其對宿主局部防御調(diào)節(jié)的影響及機制值得進一步探討。

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Effect of compound doxycycline sustained-release gel on IL-4 and TNF-αlevels in gingival crevicular fluid in rats with experimental periodontitis

CHENGFengxia,TIANHuan,WUYongsheng,etal.DepartmentofStomatology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effect of compound doxycycline sustained-release gel on gingival index (GI),depth of pocket (PD),attachment loss (AL),IL-4 and TNF-α levels in gingival crevicular fluid (GCF) of rats with experimental periodontitis.MethodsForty-two Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal control group (group N),positive control group (group C) and trial group (group T),with 14 rats in each group.After periodontitis models were established,the rats in group C were treated by minocycline ointment,however,the rats in group T were treated by compound doxycycline sustained release gel.The rats in both groups accepted treatment once a week for 4 weeks.The GI,PD,AL,IL-4 and TNF-α levels were detected and recorded before and after treatment.ResultsAfter treatment,GI,PD,AL in group C and group T were significantly decreased (P<0.05).IL-4 levels in GCF of rats with periodontitis were significantly lower than those in group N (P<0.05),however,IL-4 levels were significantly increased after treatment (P<0.05).After treatment,IL-4 levels in group T were obviously higher than those in group C (P<0.05).TNF-α levels in GCF of rats with periodontitis were significantly higher than those of group N,however,TNF-α levels were significantly decreased after treatment (P<0.05).There were no significant differences in TNF-α levels between group T and group C after treatment (P>0.05).ConclusionCompound doxycycline sustained-release gel can obviously improve clinical symptoms of periodontitis,which can obviously decrease TNF-α levels and increase IL-4 levels in GCF.

sustained-release gel; doxycycline; rhizoma drynariae; GCF; IL-4; TNF-α

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.002

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院口腔科

R 780.2

A

1002-7386(2014)06-0809-04

2013-07-11)