膽囊收縮素-8對高血壓大鼠腦出血后核因子-κB活性的影響

王恒 邵恩得 張金榮 吳立華

·論著·

膽囊收縮素-8對高血壓大鼠腦出血后核因子-κB活性的影響

王恒 邵恩得 張金榮 吳立華

目的探討膽囊收縮素-8(cholecystokinin-8,CCK-8)對高血壓性大鼠腦出血后血腫周圍組織核因子-κB(Necular Factor Kappa B,NF-κB)活性的影響。方法取成年SD大鼠72只，體重250～300 g，隨機分假手術組(n=12)、腦出血組(n=24)和CCK-8治療組(n=24)。采用電泳遷移率改變分析方法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測核內NF-κB的活性，用免疫組化方法觀察NF-κB 在細胞內的表達情況，并用干濕重法測量出血側腦組織含水量。結果腦出血組各時間點NF-κB的活性以及腦含水量較假手術組和CCK-8治療均有明顯增高(P<0.05)。結論腦出血后，腦組織NF-κB的表達明顯增加，CCK-8可以有效的抑制NF-κB的活性，這對于減輕NF-κB在腦出血后介導的繼發性炎性損害起到了積極的作用。

核因子-κB； 腦出血； 膽囊收縮素-8；炎癥

核因子-κB(NF-κB)是炎性反應調節過程中的重要轉錄因子，其活化后可激起腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素-1(IL-1)等促炎因子的表達，進而促進傷后炎性反應。研究表明，腦出血后炎性介質的大量表達與腦組織繼發損傷程度關系密切[1]。膽囊收縮素(CCK)是一種典型的腦腸肽，近年來許多學者發現CCK-8具有抑制炎性反應的作用，但國內外還沒有CCK-8在抗腦出血后繼發炎性反應方面的報道。本研究采用電泳遷移率改變分析及免疫組化的方法觀察CCK-8對高血壓性大鼠腦出血后血腫周圍NF-κB表達的影響，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 成年SD大鼠72只，體重250～300 g，隨機分為假手術組(12只)、腦出血組(24只)、CCK-8治療組(24只)，后兩組按出血后時間分為12、24、72 h三個亞組，每組8只大鼠，大鼠高血壓性腦出血模型采用雙側腎動脈前支部分熱凝，立體定位儀下自體血腦內注入法建立。CCK-8治療組于出血前30 min,按40μg/kg，經尾靜脈注射CCK-8(美國Sigma公司)，0.2 ml/只；腦出血組于試驗前30 min注射等量0.9%氯化鈉溶液，即0.2 ml/只；假手術組大鼠只制作大鼠高血壓動物模型，不進行其他操作。將各組動物按時間點斷頭處死，取出血灶前緣2 mm處腦皮質100 μg，放于-70℃冰箱保存，用做電泳遷移率改變分析NF-κB的活性，另取出血灶邊緣(200±50)mg腦皮質，用干濕重法測量腦含水量。剩余出血邊緣腦組織用4%多聚甲醛固定、脫水、包埋。將腦組織切成4 μm厚薄片，用免疫組化方法觀察腦出血后大鼠腦組織NF-κB的表達情況。

1.2 NF-κB的活性測定 參照Dignam等[2]的方法稍加改進。取出血灶邊緣2 mm處腦皮質100 μg，4℃下經磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，離心(1 850×g,5 min)，加入5倍體積的BufferA(10 mmol/L HEPES，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，pH值7.9，0.5% NP-40)，離心(1 850×g、4℃、5 min)，向細胞沉淀中加入3倍原體積的BufferB(不含NP-40的BufferA)，冰浴10 min,在Dounce氏玻璃研磨器內研磨成漿，振蕩混勻，離心(3 300×g,15 min)，去上清液，測量離心壓緊后的細胞核，加入2/3體積的BufferC(20 mmol/L HEPES pH值7.9，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，20%甘油)重懸細胞核，逐滴加入1/3體積的BufferD(20 mmol/L HEPES(pH值7.9)400 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2， 0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，20%甘油)，振蕩冰浴1 h，離心(15 000×g、4℃、30 min)，上清即為核蛋白提取液。用考馬斯亮蘭G250染色測定蛋白濃度后，分裝于-70℃保存備用。采用NF-κB凝膠遷移檢測試劑盒(美國 Promega公司)，按Gel Shift Assay System 試劑盒說明書說明，用T4多核苷酸激酶法以γ32P-ATP(北京亞輝生物公司)對NF-κB寡核苷酸探針進行放射性標記，探針序列為5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’。核蛋白與探針的結合反應，取10 μg核蛋白與γ32P標記的DNA探針(3.5 pmol,10μCi),在室溫下進行結合反應30 min，反應體系為：1 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L DTT,50 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl (pH值7.5),0.05 μg poly(dI-dC) 和4% 甘油，總體積為10 μl。反應物經4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 V，電泳40～50 min。取下凝膠放在保鮮膜上，在抽干機上抽干，放入-70℃冰箱曝光24 h，用凝膠分析軟件對特異性條帶進行光密度分析。

1.3 腦含水量測定 各組試驗大鼠按時間點斷頭處死后立即開顱，取腦出血灶邊緣約2 mm處腦皮質約(200±50)mg,用濾紙吸干表面水分，放在鋁箔上用電子天平稱濕重，然后置恒溫干燥箱內，100℃烘烤24 h,取出秤干重后計算腦組織含水量。參照Elliot公式計算，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 免疫組化法觀察NF-κB的表達 取出血灶后約4 mm層厚的腦組織進行固定和石蠟包埋，包埋好的組織蠟塊在石蠟切片機上進行連續切片，片厚約為5 μm。采用SP法進行免疫組化染色觀察，小鼠抗NF-κP65( SC-8008)單抗購Santa Cruz 公司，二抗及辣根酶標記鏈酶卵白素均購自北京中山生物工程公司，DAB鏡下顯色，細胞內出現棕黃色顆粒為陽性結果。高倍鏡下(400倍)在挫傷灶周圍隨機取4個視野計數陽性細胞。

1.5 統計學分析 應用SPSS 15.0統計軟件，計量資料以表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB的DNA結合活性分析 EMSA電泳條帶，條帶掃描結果經光密度值分析顯示,腦出血后12 h NF-κB表達明顯增加，24 h達高峰。CCK-8治療組各時間點NF-κB的DNA結合活性較腦出血組比有明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 腦含水量測定 假手術組大鼠各時間點腦組織含水量差異無統計學意義(P>0.05)。腦出血組各時間點腦含水量與假手術組相比均有增高(P<0.05)，在傷后24 h達高峰，持續到72 h。CCK-8治療組腦含水量與腦出血組比較顯著減少(P<0.05)。見表2。

2.3 免疫組織化學檢測NF-κB變化 NF-κB在神經元細胞、神經膠質細胞、血管內皮細胞內均可見陽性表達(圖2)。腦出血組大鼠腦組織12 h陽性細胞表達明顯增加，24h達到高峰，這與EMSA結果相一致。CCK-8治療組NF-κB的陽性表達明顯減少，與腦出血組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表3。

圖1 EMSA檢測各組動物不同時間點細胞核中NF-κB的DNA結合 活性

表1 3組動物不同時間點NF-κB的DNA結合活性比較

表2 3組動物不同時間點腦含水量比較

圖2 出血后各時間點大鼠腦組織NF-κB(免疫組化×400)

3 討論

NF-κB是一種具有多向性轉錄激活功能調節分子，它與靶基因上特定的κB序列結合從而調節該基因轉錄，這些基因在調控細胞的增殖、分化、凋亡、免疫及炎性反應等多方面均起著關鍵性作用。腦出血后短時間內即會出現NF-κB的活化[3]，并通過編碼ICAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6等因子的表達參與顱腦出血后的炎性反應過程，由于TNF-α和IL-1這兩個因子又是NF-κB的激活物，它們與NF-κB共同形成了一個正反饋系統，所以一旦NF-κB激活引起炎性反應，這一反應將會持續一段時間，在腦出血后NF-κB的高表達正是通過繼發性炎性反應這一過程加重了腦損傷[4]。

表3 3組動物不同時間點NF-κB陽性細胞表達情況比較

我們試驗結果顯示，大鼠急性腦出血后12 h NF-κB表達明顯增加，主要表現在神經元細胞和小膠質細胞內，24 h表達達高峰，72 h后表達開始下降，但仍高于假手術組。通過EMSA對NF-κB的DNA結合活性進行分析，其結果與免疫組化結果完全一致。為了更好的說明NF-κB與腦出血后繼發性炎性損傷的關系，我們還檢測了大鼠腦出血后腦含水量的變化，腦出血組大鼠在傷后12 h 挫傷灶周圍腦組織含水量明顯升高，24 h達到高峰，并持續升高到72 h，與劉春梅等[5]研究結果一致。由此可見NF-κB的活性表達與腦組織損傷后組織形態學變化在時間上具有一致性，說明NF-κB在出血后通過級聯擴大的炎性反應加重了腦組織水腫，在腦出血后繼發性損傷過程中扮演了重要的角色[6]。

膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是一種典型的腦腸肽，主要化學成分為氨基酸多肽。CCK在人腦中主要分布于大腦皮層、海馬、杏仁核、下丘腦、脊髓等。在CCK家族中CCK-8的硫化形式(CCK-8s)是可發揮生物學效應的最小的活性片段。研究表明CCK-8在脂多糖誘導的肺組織炎癥中有抑制NF-κB的活性和炎性因子的促炎作用，有效減輕了脂多糖引起的肺組織病理組織學變化[7]。扈玉華等[8]通過實驗觀察到CCK-8可顯著抑制大鼠脊髓損傷后NF-κB活性的表達，并具有劑量依賴性，其減輕了脊髓傷后繼發性炎性損傷。我們的結果顯示，CCK-8治療組大鼠腦組織NF-κB表達較腦出血組比較明顯減少(P<0.05)；同時我們檢測的腦含水量結果顯示，CCK-8治療組腦含水量明顯低于腦出血組(P<0.05)。這一結果充分說明CCK-8在腦出血后的繼發性損傷過程中起到了積極的保護作用。

在腦出血后NF-κB通過激活TNF-α、IL-1等炎性因子的表達，使血腫周圍腦組織的炎性反應進一步擴大，加重了腦組織的繼發性損傷。CCK-8可有效的對NF-κB的活化進行抑制，從而減少了其下游激活產物引起的繼發性炎性損害。CCK-8抑制NF-κB活化的機制我們可歸結為：(1) 抗氧化作用，目前大量實驗證實神經系統損傷早期即有氧自由基增加和細胞膜脂質過氧化的現象。已知氧化應激是NF-κB激活的重要途徑，而CCK-8可提高血液超氧化物酶歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，其具有抗氧化效應[9]，從而間接的抑制了NF-κB的激活；(2) 抑制IκB的降解，在IκB介導的對NF-κB抑制的過程中需要p38 MAPK的激活，而CCK-8可以增強p38MAPK的活性程度[10]，從而間接的增強了IκB對NF-κB的抑制。CCK-8與其受體結合后，可激活cAMP-PKA信號傳導途徑，從而抑制IκB蛋白的降解；(3)抑制TNF-α基因的表達，TNF-α是一個早期的重要炎性介質，由于TNF-α能促進IL-1和IL-6等炎性介質的產生，并且與NF-κB形成正反饋激活機制，所以其結果可以引起級聯式的炎性反應，引起持續損害。研究發現CCK-8能顯著抑制TNF-α的活性表達[11]，這一結果也提示我們CCK-8也通過這一途徑間接抑制了NF-κB的活化。

總之，在腦出血后所引起的繼發性炎性損害中，NF-κB的高度表達扮演了關鍵的角色，而CCK-8通過對NF-κB活性的抑制作用，有效的減輕了這一損傷程度。這為我們對臨床腦出血的治療提供新的思路，本實驗是有關CCK-8在腦出血后應用的初步研究，其中的許多病理生理機制仍未闡明，相信通過以后進一步研究會為腦出血的治療提供更為廣闊的前景。

1 Wang J.Precl inical and clinical research on inflammati on after in 2 tracerebral hemorrhage.Prog Neurobiol,2010,92: 463-477.

2 Dignam JD,Lebovitz RM,Roeder RG.Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.Nucleic Acids Res，1983,11:1475-1489.

3 劉宗超,饒明俐,周官恩.實驗性腦出血中NF-κB的動態表達及其與凋亡的關系.中風與神經疾病雜志,2007,24:288-290.

4 Aoki T,Nishimura M.Targeting chronic inflammation in cerebral aneurysms: focusing on NF-kappaB as a putative target of medical therapy.Expert Opin Ther Targets，2010,14:265-73.

5 劉春梅,周俊山.腦出血大鼠血腫周圍腦組織白細胞和凋亡細胞變化及其與腦組織含水量的關系.臨床神經病學雜志,2011,24:368-371.

6 Joice SL,Mydeen F,Couraud PO,et al.Modulation of blood-brainbarrier permeability by eutrophils: in vitro and in vivo studies.Brain Res,2009,1298: 13-23.

7 叢斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用.中國病理生理雜志,2000,18: 615-618.

8 扈玉華，張慶俊，叢斌，等.膽囊收縮素-8對大鼠急性脊髓損傷核因子-κB活性的影響.中華物理醫學與康復雜志,2001,23: 345-347.

9 Chefetz L,Holmberg JC,Alvero AB,et al.Inhibition of Aurora-A kinase induces cell cycle arrest in epithelial ovarian cancer stem cells by affecting NF-κB pathway.Cell Cycle，2011,10:2206-2214.

10 Perkins ND.Integrating cell-signalling pathways with NF-kappaB and IKK function.Nat Rev Mol Cell Biol，2007,8:49-62.

11 孟愛宏，凌亦凌，閻錫新，等.CCK-8對LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞p38MAPK、STAT3表達及TNF-α活性的影響.國際呼吸雜志，2007,27: 84-87.

Effects of cholecystokinin 8 on NF-κB activity in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage

WANGHeng,SHAOEnde,ZHANGJinrong,etal.DepartmentofNeurosurgery,LangfangPeople’sHospital,HebeiLangfang065000,China

ObjectiveTo investigate the effect of cholecystokinin-8 (CCK-8) on the changes of Necular Factor Kappa B (NF-κB) activity in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage.MethodsSeventy-two adult Sprague-Dawley rats,weighted 250～300g,were randomly divided into three groups: control group,cerebral hemorrhage group and CCK-8 treatment group.The activity of NF-κB was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and the expression of NF-κB in cells was detected by immunohistochemical methods,and water content in brain tissue of injury part was measured.ResultsThe activity of NF-κB and brain water content in cerebral hemorrhage group were significantly increased,as compared with those in control group and CCK-8 group (P<0.05).ConclusionThe expression levels of NF-κB are obviously increased immediately after intracerebral hemorrhage,and CCK-8 can inhibit effectively the activity of NF-κB,which relieves the damage of secondary inflammatory reaction induced by NF-κB after intracerebral hemorrhage.

NF-κB;cerebral hemorrhage; CCK-8; inflammation

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.003

065000 河北省廊坊市人民醫院神經外科(王恒、邵恩得、張金榮)，磁共振導航介入診療科(吳立華)

邵恩得，065000 河北省廊坊市人民醫院神經外科；

E-mail: endeshao@163.com

R 743.34

A

1002-7386(2014)06-0812-04

2013-10-18)