血紅素加氧酶-1在食管癌放療前后變化及意義

王獻偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

·論著·

血紅素加氧酶-1在食管癌放療前后變化及意義

王獻偉 黃金娜 王愛玲 李延峰 解俊霞

目的通過檢測食管癌患者放療前后食管癌組織中血紅素加氧酶-1(HO-1)的變化，確定HO-1是否可能預測食管癌患者對放射治療存在敏感性。方法選取28例正常食管組織及58例食管癌組織，應用RT-PCR(real-time PCR)檢測HO-1基因的mRNA表達，分析其在正常組織及食管癌放療前后關系。結果HO-1在食管癌中表達明顯升高與正常食管組織表達差異有統計學意義(P<0.01)，并且隨著放療劑量的增加HO-1水平也隨之升高，但是在放療不敏感的患者中HO-1表達與正常相比差異無統計學意義(P>0.05)。結論目前的研究結果表明HO-1的表達可能是食管癌患者對放療敏感的一個有用的指標。

血紅素加氧酶-1；食管腫瘤；放療

放射治療是食管癌一種有效的治療方式，但其療效卻是不盡如人意。如果用一種指標來預測放療敏感性將對眾多的食管癌患者帶來很大益處，并且可以避免因為化療不敏感造成的人體損害和經濟損失。到目前為止，腫瘤對于每個人的放療反應還是不可預知的。放療不敏感，涉及因素眾多而臨床上知之甚少，主要涉及一些臨床因素如腫瘤不同的進展階段，組織學分級，局部浸潤和個人的耐受性。許多生物因素包括腫瘤缺氧，Ki-67，p53，c-erbB-2，和谷胱甘肽轉移酶也被發現與抗輻射有關[1]。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種存在最為廣泛的抗氧化防御酶,是熱休克蛋白家族中的成員之一,可將血紅素分解為一氧化碳(carbon monoxide，CO)、Fe、膽綠素；HO-1的抗氧化功能與它能阻止游離血紅素參與氧化反應有關系。同時HO-1的代謝產物(CO、膽紅素、轉鐵蛋白)均有抗氧化功能，是HO發揮抗炎抗氧化、抗凋亡及抗增生作用的重要效應分子。HO-1在食管癌患者放療前后的表達，至今國內外少見有人報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集石家莊市中心醫院腫瘤科自2011年1月至2013年7月所收治58例食管癌患者的食管癌組織，同期從我院內鏡室收集28例正常食管組織。所有組織標本均經病理檢查證實，臨床資料完整。58例食管癌患者分類均為食管鱗癌，未發現遠處轉移，且均為首次接受單純放射治療。其中男36例，女22例；年齡38～72歲，平均年齡54歲。2組間性別比、年齡、分期評分及臨床癥狀差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法 放療方法: MV-X線常規分割放療每次2 Gy，每周5次，總量達20 Gy/4周后，根據放療前胸部CT片和即時復查的食管鋇餐片縮野。休息1周，按照前面步驟再照兩個療程，總量分別達40 Gy和60 Gy。每周食管鏡復查了解腫瘤退縮情況，有無穿孔征象以及照射位置是否變動。

1.3 預后標準[2]完全緩解(CR)：病變完全消失，持續時間≥4周；部分緩解(PR)：病變縮小≥50%，持續時間≥4周，并且沒有任何舊有病灶增大和新的病灶出現；無變化(NC)：腫塊縮小<50% 或增大<25%；進展(PD)：一個或多個病灶增大≥25%，或出現新病灶。

1.4 組織RNA的提取 取50～100 mg組織加入1 ml TRIzol，用勻漿儀進行處理。將勻漿樣品在冰溫狀態放置5 min，以1∶0.2的比例加入氯仿，渦旋式振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃ 12 000 r/min條件下離心15 min。再把水相轉移到新管里，使用異丙醇沉淀水相中的RNA。加入25～200 μl無RNase的水溶解RNA。使用Invitrogen M-MVL cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA。PCR反應：以cDNA為模板，按相應的引物及反應條件進行擴增。HO-1的上游引物為5’GCTCAAAAAGATTGCCCAGA 3’ 下游引物5’GCGGTAGAGCTGCTTGAACT 3’。擴增產物110 bp。反應條件94℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃10 min，35個循環。反應體系為50 μl，取反應的產物5 μl在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統下觀察產物條帶的位置。

1.5 凝膠圖像分析 采用熒光化學發光凝膠成像系統來分析HO-1基因的電泳結果。檢測擴增PCR產物量，并以積分光密度(IOD)表示。IOD計算方法為電泳條帶平均光密度×電泳條帶面積。組織中各HO-1基因rRNA的表達量用與β-Actin條帶的IOD 比值表示。

1.6 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件，HO-1表達水平以表示，2組間比較采用t檢驗，多組內比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HO-1基因mRNA擴增產物檢測結果 對食管癌組織HO-1擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖1 食管癌組織HO-1表達量PCR擴增產物電泳圖

2.2 食管癌組織中HO-1的表達量與放療前組織比較差異有統計學意義(P<0.05)，放療劑量越大其表達量越高。見表2、3。

表1 HO-1在放療前后食管癌組織中表達水平

2.3 食管癌患者不同的預后食管癌組織中的HO-1的表達量不同，預后越好HO-1的表達量越高，預后越差HO-1表達量越低。不同的預后統計學分析差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 HO-1在不同照射量食管癌組織中表達水平與預后

3 討論

HO-1是一種保護細胞及抗氧化損傷的酶類。在細胞生長發育過程中起著重要的作用，是腫瘤細胞生長的依賴蛋白；其在大多數組織中呈低表達水平,但可被多種刺激因素誘導而產生高水平表達[3]。然而，但HO-1的分子結構、催化反應機制、調控系統尚未得到很好了解，本文是第一次報告食管癌放射敏感性和HO-1表達的關系。HO-1在食管癌中表達明顯升高與正常食管組織表達有明顯統計學差異，并且隨著放療劑量的增加HO-1水平也隨之升高。此外，對于NC和PD類患者，HO-1表達水平較低與正常對照組相比幾乎沒有區別，說明HO-1表達水平較低的患者可能不適合放射治療。這個發現似乎是自相矛盾的因為HO-1被認為對各種炎癥性疾病起到了保護作用。然而，抗休克蛋白(HSP)在抗輻射的作用是已知[4,5]。目前還不清楚為什么一個高表達HO-1的腫瘤患者有更好的放射敏感性相比表達較低HO-1腫瘤患者。Deramaudt等[6]研究結果表明，HO-1基因的過度表達可能跟幾個轉錄因子之間相互做有關，如NF-κB、 AP-1、AP-2。我們的研究結果可能只是反映了上調這些轉錄因子，這些僅參與細胞增殖和/或分化[7]。事實上，迅速增殖的腫瘤比增長緩慢腫瘤對放射治療更敏感。

總之，我們的數據表明，HO-1是一種新的指標預測食管鱗狀細胞癌對放射治療的敏感性。然而，由于本文樣本較少，所以上述結果尚需一個較大數量樣本來進行評估，以確認HO-1確切表達量與腫瘤放射敏感性之間的尺度。

1 任金山，吳紅芳.K i-67與食管鱗癌放療敏感性的相關研究.中國現代藥物應用，2011，5:37-38.

2 李勇強，王智.食管癌中MT-3基因mRNA的表達與含量差異性分析.成都醫學院學報，2012,7：217-219.

3 朱子夫，馬莉，HO-1抗氧化損傷的研究進展.醫學綜述，2010,16:2266-2270.

4 Fortin A,Raybaud-Diogene H,Tetu B,et al.Overexpression of the 27 kDa heat shock protein is associated with thermoresistance and chemoresistance but not with radioresistance.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2000,15: 1259-1266,

5 Baek SH,Min JN,Park EM,et al.Role of small heat shock protein HSP25 in radioresistance and glutathione-redox cycle.J Cell Physiol,2000,183:100-107.

6 Deramaudt BMJM,Remy P，Abraham NG.Upregulation of human heme oxygenase gene expression by Ets-family proteins.J Cell Biochem,1999,72:311-321.

7 蔣曉剛，韓燕，楊旭東，等.AP1 與NF-LKB 對PPARδ基因的轉錄調控作用.西安交通大學學報(醫學版)，2012,33:560-563.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.06.009

項目來源：河北省醫學科學重點課題(編號：20120447)

050011 河北省石家莊市第一醫院(王獻偉、王愛玲、李延峰)；河北省醫學情報研究所(黃金娜、解俊霞)

R 735.1

A

1002-7386(2014)06-0832-02

2013-09-16)