極地抗植物病原真菌活性菌株PKS和NRPS基因的克隆與分析*1

彭玉嬌，李敬龍，林學政

(1. 齊魯工業大學 食品與生物工程學院，山東 濟南 250353； 2. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 3.國家海洋局 海洋生物活性物質重點實驗室，山東 青島 266061)

極地抗植物病原真菌活性菌株PKS和NRPS基因的克隆與分析*1

彭玉嬌1,2,3，李敬龍1，林學政2,3*

(1. 齊魯工業大學 食品與生物工程學院，山東 濟南 250353； 2. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 3.國家海洋局 海洋生物活性物質重點實驗室，山東 青島 266061)

植物常見病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為指示菌，采用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細菌進行了抑菌活性驗證，并對其中活性較強的菌株進行了分子鑒定與系統發育分析及次級代謝產物合成功能基因(PKS和NRPS)的克隆與分析。結果表明，38株極地細菌中，13株具有明顯的抗病原真菌活性；分子鑒定與系統發育分析表明，11株活性菌株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter；對活性菌株PKS和NRPS基因的克隆與分析表明，從10株活性菌株克隆到12條NRPS A結構域基因片段，其中5株活性菌株同時含有PKS I型 KS結構域基因片段。據此為從聚酮和非核糖體肽等生物合成途徑深入研究活性菌株的次級代謝產物提供了基因學證據。

極地細菌；抑菌活性；多聚酮合酶；非核糖體肽合成酶

微生物來源的天然產物一直是發現新型藥物先導化合物的重要來源。經過長期和廣泛深入的研究之后，從陸地微生物中發現新的天然產物已越來越困難，而蘊涵著極其豐富生物資源的海洋微生物種群則是當今天然產物藥物開發的巨大寶庫。極地自然環境與地理環境的特殊性決定了極地微生物具有巨大的研究與開發潛力。隨著新的病原微生物及其耐藥性的不斷出現，能否快速篩選到具有新結構、新活性的微生物代謝產物已成為新藥研究迫切面對的問題[1]。

海洋微生物的次級代謝產物主要為聚酮類化合物和肽類化合物，負責該兩類化合物生物合成的酶分別為聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)[2]。PKS是一類復雜的多酶體系，多以簡單的脂酰CoA為底物，通過重復的脫羧縮合過程產生線性聚酮化合物或環狀的酮內酯，其過程類似于脂肪酸合酶催化的脂肪酸生物合成[3]。目前,普遍認為PKS分為I型、II型和III型三種類型,其中，尤以PKS I型途徑合成的化合物結構多樣、活性范圍廣著稱[4]。這些聚酮化合物大多具有激素、抗生素、抗真菌素、抗腫瘤等生物活性，在至今上市的醫藥或農用抗生素結構中聚酮類化合物來源的比例居已知六大類天然產物的首位，具有重要的商業價值。在細菌和真菌中，一些重要多肽類物質的合成可以繞開核糖體，在這一類特殊的多肽化合物合成中起關鍵作用的一類特殊的酶就是非核糖體肽合成酶(NRPS)[5]。NRPS由多個模塊組成，特定模塊的結構域具有特定的酶活，催化相應單體結合到新生肽鏈中。這些結構域包括腺苷酰化結構域(A結構域)、巰基化結構域(T結構域)、縮合結構域(C結構域)、差向異構結構域(E結構域)和甲基化結構域(M結構域)等[6]。據報道，已經發現的NRPS產物中稀有氨基酸多達300個，它們主要來源于E結構域的差向異構化、M結構域的N-甲基化和其它結構域的?；?、糖基化及雜環化修飾[7]，這正是這類代謝產物多樣化的原因。NRPS合成的多肽類化合物具有獨特多樣的生物活性，已被廣泛應用和研究。應用最多的是多肽類抗生素，如萬古霉素、Daptomycin、桿菌肽等，此外還可以作為免疫抑制劑藥物、生物表面活性劑、抗癌藥物、細胞生長抑制劑和抗病毒藥物等[8]。

本研究以尖孢鐮刀菌為指示菌對實驗室保藏的38株極地細菌進行了抑菌活性驗證，對其中具有較強抑菌活性的菌株進行了基于16S rRNA基因的分子鑒定與系統發育分析；并對次級代謝產物合成基因PKS、NRPS進行了克隆與分析，以期為從生物合成途徑深入研究其次級代謝產物提供分子生物學的證據，并為今后開發利用極地微生物次級代謝產物的生物合成提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 菌 株

極地抗植物病原真菌活性菌株為國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室分離并保存；以植物病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)作為抗植物病原真菌指示菌;感受態細胞EscherichiacoliDH5α購于TaKaRa公司。

1.2 培養基與菌株活性驗證

海水Zobell 2216 E培養基、PDA培養基和LB培養基配置及菌株的活性驗證(平板擴散法)均參照文獻[9]。

1.3 實驗儀器及試劑

pMD18-T Vector (TaKaRa，D101A)；細菌基因組提取試劑盒(TIANGEN，DP302-02)、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN，DP209-02)、2×Taq PCR MasterMix (TIANGEN，KT201)。

1.4 活性菌株基因組DNA的提取

按照細菌基因組提取試劑盒的操作步驟提取細菌基因組DNA，將提取的細菌基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃儲存。

1.5 16S rRNA基因擴增

以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3′)為引物，使用50 μL擴增體系(1 μL 27F，1 μL 1492R，25 μL Master Mix，23 μL ddH2O)，PCR反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 10 min，進行16S rRNA基因擴增。

1.6 PKS與NRPS基因擴增簡并引物與基因克隆

以PKS-U(5′-GCGATGGATCCNCAGCAGCG-3′)和PKS-D(5′-GTGCCGGTNCCGTGNGYYTC-3′)為引物[2]，使用50 μL擴增體系，PCR反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 10 min，進行PKS基因擴增。

以NRPS-U (5′-GCSTACSYSA TSTACACSTCSGG-3′)和NRPS-D (5′-SASGTCVCCSGTSCGG TAS-3′) 為引物[2]，使用50 μL擴增體系，PCR反應條件為50 μL擴增體系，反應條件為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min，進行NRPS基因擴增。

擴增到的目的基因經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen，DP209-02) 回收，操作步驟按其說明書進行。

1.7 序列測定及分析

將PCR反應得到的目的條帶切膠回收，連接T載體pMD18-T后，轉化感受態細胞E.coli DH 5α。將經T載體特異性引物M13-47/RV-M驗證后的陽性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將得到的目標片段序列采用BALST程序進行同源比對分析并提交GenBank數據庫，利用軟件Mega 4.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性與系統發育分析

以尖孢鐮刀菌為指示菌，利用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細菌進行了抗植物病原真菌活性驗證。結果表明，其中13株菌株具有明顯的抑菌活性，對其進行了16S rRNA基因擴增與分析，將得到的序列提交GenBank，經BLAST比對得到最高相似菌株，并利用Mega 4.0軟件構建系統發育樹，結果分別見表1和圖1。

表1 活性菌株分子鑒定及其抑菌效果Table 1 identification of antifungal strains and their antifungal effects

從表1中可以看出，38株極地活性菌株中有13株具有明顯的抑菌活性(抑菌圈直徑均>16 mm)；其中菌株C-1抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑達到26.0 mm。菌株11W、83-1、195、2-Z18、P406、P4-11-07和P499抑菌效果也比較顯著，均在20 mm以上；本研究中活性菌株絕大多數與GenBank數據庫中已有菌株的16S rRNA 基因序列存在著很高的相似性，相似性均在99%以上，且假單胞菌屬(Pseudomonas)活性菌株的抑菌活性明顯高于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和節桿菌屬(Arthrobacter)的活性菌株；13株活性菌株分別屬于3個屬，其中11株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter。

圖1 抗菌活性菌株的16S rRNA序列系統發育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of antimicrobial bacteria based on 16S rRNA gene sequences

注：節點處的數字表示在1 000次運算中出現的概率，只表示出了≥50%的情況

2.2 PKS基因的擴增結果與系統發育分析

利用簡并引物PKS-U/PKS-D從13株活性菌株中擴增PKS基因，將處理好的測序結果提交至NCBI并使用BLASTX功能進行基因比對，活性菌株PKS基因的擴增及分析結果見表2。由表2可以看出從5株活性菌株(C-1、P499、83-1、P406和205)中成功擴增到PKS基因片段，長度在1 125～1 143 bp之間，其余8株均未成功擴增出PKS片段；從5株活性菌株中擴增到的5條PKS基因片段均與Pseudomonas brassicacearum NFM421的酰基轉移酶(PKS)的基因序列相似度最高，相似度在88%左右。將得到的PKS基因的核苷酸序列提交至GenBank數據庫，獲得序列注冊號為：KF297895～KF297899。

表2 所獲PKS片段與GenBank中氨基酸序列同源性狀況Table 2 PKS gene fragments obtained in present study and their identities in the GenBank

將本研究得到的PKS基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用Mega 4.0軟件構建系統發育樹，結果見圖2。

通過基于PKS氨基酸序列的系統發育分析(圖2)，推斷本研究得到的PKS基因片段編碼的蛋白序列都屬于KS結構域的trans-AT型，這種類型的PKS被認為與有藥物活性的代謝產物的產生有關[10]。這與抑菌活性實驗結果一致，成功擴增出PKS基因片段的菌株C-1、P499、83-1、P406、205在抑菌活性實驗中均表現出較強的抑菌活性。這說明PKS基因可能與具有抗植物病原真菌活性的化合物的合成有關。

圖2 基于PKS氨基酸序列的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on amino PKS acid sequences using neighbor-joining method

2.3 NRPS基因的擴增結果與系統發育分析

利用NRPS簡并引物從13株活性菌株中擴增NRPS基因，將處理好的測序結果提交至NCBI并使用BLASTX功能進行基因比對，結果從10株活性菌株中擴增到NRPS基因的片段,擴增結果及分析見表3。

表3 所獲NRPS片段與GenBank中氨基酸序列同源性狀況Table 3 NRPS gene fragments obtained in present study and their identities in the GenBank

從表3中可以看出,從10株活性菌株(C-1、83-1、P406、P499、205、195、P4-11-07、LX-4、2-Z18和11W)中成功擴增出了12條NRPS基因片段，長度在684～720 bp之間，與預期基因片段的長度一致。這說明NRPS基因在Pseudomonas中能廣泛存在。從表中可以看出除菌株P499和菌株11W的NRPS基因序列與數據庫菌株蛋白Amp-binding enzyme(NRPS基因)基因序列的相似度最低，為88%。其他菌株的相似度均在90%以上。12株活性菌株的氨基酸序列與數據庫相似的菌株主要為PseudomonasfluorescensSS101和Pseudomonassp. R81。將得到的NRPS基因的核苷酸序列提交至GenBank數據庫，獲得序列注冊號為：KF026290～KF026301。

值得指出的是，從菌株C-1和P499均成功擴增出2條NRPS基因片段，分別為NRP17/NRP19和NRP4995/NRP4998。由BLAST結果可知，片段NRP17與菌株PseudomonasfluorescensSBW25的NRPS A域相似性最高，為90%；片段NRP19與菌株Pseudomonassp. R81的NRPS A域相似性最高，為94%；片段NRP4995與菌株Pseudomonassp. R81的NRPS A域相似性最高，為94%；片段NRP4998與菌株PseudomonasfluorescensSBW25的NRPS A域相似性最高，為89%。由BLAST可知，從菌株C-1克隆到的2個NRPS基因片段NRP17和NRP19的氨基酸序列相似度僅為35%;從菌株499克隆到的2個NRPS基因片段NRP4995和NRP4998的氨基酸序列相似度僅為38%。由此得出，從同一菌株中擴增出的2條NRPS片段相似度均較低。

將本研究得到的NRPS基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用Mega 4.0軟件構建系統發育樹,結果見圖3。

圖3 基于NRPS氨基酸序列的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on NRPS amino acid sequences using neighbor-joining method

BLAST結果及NRPS系統發育樹(圖3)均表明本研究所得NRPS基因片段編碼的蛋白序列為NRPS基因簇的腺苷?；Y構域(adenylation，A)，且供試的11株Pseudomonas菌株除1株未得到NRPS片段外，其余10株均成功擴增到NRPS片段，說明NRPS基因在Pseudomonas中廣泛存在。

3 討 論

本研究以尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為指示菌，采用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細菌進行了抑菌活性驗證，并對其中活性較強的菌株進行了基于16S rRNA的分子鑒定與系統發育分析以及PKS和NRPS基因的克隆與分析。

活性驗證實驗表明，38株極地細菌中13株具有較強抗菌活性；分子鑒定與系統發育分析表明，11株菌株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter?；钚澡b定實驗表明Pseudomonas屬菌株具有較強的抑菌活性。近年來對于Pseudomonas菌株產生活性物質的研究已有若干報道，例如溫露等[11]對海洋細菌Pseudomonassp.的次級代謝產物進行了研究，從其中分離到一個藍色素，生物活性試驗顯示該藍色素,對腫瘤細胞生長有很強的抑制作用。漆淑華等[12]根據活性追蹤從海洋細菌Pseudomonassp. 發酵液中分離到4個環二肽，可抑制多種能誘導海洋生物幼蟲附著的細菌的生長。

11株Pseudomonas活性菌株中，除菌株BN05-S-2外，其余10株菌株均成功擴增出NRPS基因片段。經BLAST比對與系統發育樹分析可見，本研究所得到的12條NRPS片段均屬于NRPS的A結構域，表明NRPS基因在Pseudomonas中廣泛存在。在16S rRNA系統發育樹中進化關系較近的11W、LX-4、2-Z18、83-1等菌株的NRPS 基因的A結構域并不在一個分支上，遺傳距離較遠，由此證明了它們可能并非同一株菌，同時也證明了得到的NRPS基因片段的多樣性[13]。值得指出的是，從菌株C-1和P499均成功擴增出2條NRPS基因片段，分別為NRP17/NRP19和NRP4995/NRP4998。從同一菌株中擴增出2條NRPS A域片段，且均分別不在一個系統發育分支上；BLAST結果和氨基酸系統發育樹均說明從同一菌株中擴增出的2條A域片段相似度較低，這也從另一方面證明了NRPS基因的多樣性。董曉毅等[14]針對我國東海海域不同生境樣品進行I型PKS基因篩選實驗中也從同一株菌中擴增到2條相似度較低的基因片段，這可能是由于設計的簡并引物特異性較低導致，但具體原因未見報道。

5株Pseudomonas活性菌株C-1、P499、83-1、P406和205均成功擴增出PKS KS結構域片段，由系統發育樹可以推斷這5條PKS片段均屬于trans-AT型。PKS I型基因通常合成一些活性物質尤其是具有抑菌活性的化合物或抗生素的前體，在生物防御中扮演著重要角色。在本研究中獲得PKS基因的5株菌對尖孢鐮刀菌均表現出較強的抑菌活性，也進一步說明從這些菌群里發現能產生新型活性化合物的活性菌株的可能性。1993年從Bacillussubtilis168的基因組測序中第一次發現trans-AT型PKS以來，越來越多的trans-AT型PKS被發現，一些重要的藥用化合物，如莫匹羅星，卡蘭殺菌素，苔蘚抑素A，和維吉霉素M等都被證實是由trans-AT型PKS產生[15]。

近年來已有若干對Pseudomonas菌株功能基因的研究報道，例如：Philippe等[16]對從植物根部分離的Pseudomonasbrassicacearum進行PKS基因的克隆與序列分析，結果發現該菌株含有?；D移酶基因與大環酯類流出蛋白基因，這兩種蛋白基因都屬于PKS基因；劉雙霜等[17]針對NRPS的Amp-binding 腺苷化結構域編碼基因設計引物，對從中國舟山海域海水篩選的嗜鹽假單胞菌進行PCR擴增，結果18株假單胞菌中有8株菌株擴增到目的片段；Mossialos等[18]也從Pseudomonasfluorescens擴增出NRPS基因目的片段。目前，針對極地細菌次級代謝產物合成功能基因如PKS與NRPS的研究尚未見報道。

目前對于PKS和NRPS基因多樣性的研究也有若干報道，不同生境微生物中PKS和NRPS基因具有豐富的多樣性，已有對海綿、總草苔蟲等海洋無脊椎動物，陸地土壤、南極土壤、紅樹林植物根際土壤[19]等環境樣品中微生物次級代謝產物多樣性的報道。Ginolhac等[20]研究發現海洋沉積物中微生物種類繁多，不同環境的海洋沉積物中可能蘊含著豐富的新型PKS功能基因；董曉毅等[14]從東海洋山港沿岸土壤、海水及海底沉積物等不同生境中獲得了23條PKS片段，說明不同生境中PKS基因的多樣性；朱文勇等[21]通過PCR篩選，從云南大學的喜樹內生放線菌中檢測到了PKSI、PKSII、和NRPS基因，陽性率分別為31.1%，48.9%和45.6%。

極地適冷菌中PKS和NRPS基因的發現，為活性代謝產物的來源進一步提供了證據。菌株C-1和P499中2種NRPS基因片段的發現，意味著其中的代謝產物可能更加豐富?；赑KS和NRPS基因的多樣性和新穎性，可以指導篩選具有藥用價值的新化合物合成能力的活性菌，因此菌株C-1、P499、83-1、P406和205值得進一步深入研究。PKS和NRPS可以合成抗細菌、抗真菌、抗腫瘤等多種活性物質，對分離到的具有抗菌活性的菌株進行進一步的基因克隆，或許可以從分子生物學的角度來分析、闡述和推測菌株具有的生物活性物質的天然產物結構類型和合成機理[2]，這也是今后筆者研究的重要方向。

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CloningandAnalysisofPKSandNRPSGenesFromPolarBacteriaWithAntifungalActivityAgainstPlantPathogenicFungi

PENG Yu-jiao1,2,3, LI Jing-long1, LIN Xue-zheng2,3*

(1.CollegeofFoodandBiologicalEngineering,QiluUniversityofTechnology, Jinan 250353, China; 2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China; 3.KeyLaboratoryofMarineBioactiveSubstances,SOA, Qingdao 266061,China)

The antifungal activity against plant pathogenic fungiFusariumoxysporumof 38 strains of polar bacteria was validated by method of agar diffusion. The results showed that 13 strains had obvious antimicrobial activity. Molecular identification and phylogenetic analysis on the basis of 16S rRNA gene indicated that 11 strains belonged to genus ofPseudomonasand 2 strains belonged to genus ofPsychrobacterandArthrobacterrespectively. The PKS and NRPS genes of these antifungal strains were also cloned and analyzed, which might be responsible for biosynthesis of bioactive secondary metabolites. The 12 gene fragments of the domain A of NRPS and the domain KS of type I PKS were cloned from 10 and 5 antifungal strains, respectively. This paper provides a genetic evidence for deeply study these antifungal strains in which the PKS and NRPS biosynthetic pathways may applied.

Polar bacteria; antimicrobial activity; PKS; NRPS

September 13, 2013

2013-09-13

海洋公益性行業科研專項經費項目——深遠海(極地)微生物生物農藥的研制與中試示范 (201005032-2)

彭玉嬌(1989-)，女，山東青島人，碩士，主要從事極端環境微生物方面研究. E-mail：pengyujiao12@163.com

*通訊作者，E-mail：linxz@fio.org.cn

(王佳實 編輯)

Q939

A

1671-6647(2014)03-0396-09