甲醛與重金屬二元混合體系對發光細菌的聯合毒性

錢驍等

摘要：以甲醛及4種重金屬Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）為研究對象，以費氏弧菌為受試生物，分別測定5種物質的單一急性毒性及甲醛與重金屬二元混合體系的聯合毒性，并利用DA模型和IA模型對二元混合體系的聯合毒性進行預測及驗證。結果表明，依據EC50大小判定5種物質的急性毒性大小順序為Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、甲醛、Cd（Ⅱ）。DA模型和IA模型都可以較好地預測混合體系“甲醛+Cd（Ⅱ）”、“甲醛+Cu（Ⅱ）”、“甲醛+Pb（Ⅱ）”對發光細菌的聯合毒性效應，IA模型預測效果比DA模型更好；對于混合體系“甲醛+Zn（Ⅱ）”的聯合毒性，兩種模型的預測都不準確。

關鍵詞：發光細菌；甲醛；重金屬；聯合毒性；DA模型；IA模型

中圖分類號：X830.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3034-05

The Joint Toxicities of Binary Mixtures Composed of Formaldehyde and

Heavy Metal to Vibrio fischeri

QIAN Xiao1，2，LIU Rui-zhi2，WANG Jing1，2，LI Jie1，LEI Kun2，LI Yi-hong2

（1.Institute of Environment & Municipal Engineering， Qingdao Technological University， Qingdao 266033， Shandong， China；

2.Chinese Research Academy of Environment Sciences，Beijing 100012， China）

Abstract： Formaldehyde and four heavy metals Cd， Cu， Pb， Zn were used as objects. Vibrio fischeri was used as the indication organism. The single toxicities of these five toxic materials and the joint toxicities of binary mixtures （composed of formaldehyde and heavy metal） were determined. The results showed that the order of the single toxicities to Vibrio fischeri was Pb>Zn>Cu>formaldehyde>Cd by EC50 values. The joint toxicities of formaldehyde and Cd or Cu or Pb could be predicted well by the DA model and the IA model. The results of IA model were better than that of DA model.

Key words：Vibrio fischeri； formaldehyde； heavy metals； joint toxicities； dose addition model； independent action model

聯合作用是指兩種或兩種以上化學物質同時或先后與受試生物接觸并發生作用時，各物質仍保留或改變各自毒性作用的現象，兩種或兩種以上化學物質在聯合作用條件下測定的毒性稱為聯合毒性[1]。對于化學物質聯合毒性的評價工作開始于20世紀70年代，傳統的聯合毒性評價方法有：毒性單位法、相加指數法、混合毒性指數法、相似性參數法、等效線圖法等[2]，這些方法只是考慮了混合體系濃度空間分布的一個點，具有很大的局限性[3]。數學模型方法可以用來綜合分析混合體系對發光細菌的毒性作用規律，在聯合毒性的評價及預測方面具有廣闊的發展前景。目前普遍應用的聯合作用預測模型有加和作用（Dose Addition，DA）模型[4]和獨立作用（Independent Action，IA）模型[5，6]。

甲醛和重金屬是環境污染中較為常見的兩類污染物質，都具有強烈的致癌、致畸等作用[7-10]，長期接觸低劑量的甲醛與重金屬會引起各種病變，對人體的危害很大。目前，國內外對重金屬及甲醛的發光細菌法毒性研究的報道很多[11-14]，但鮮有甲醛、重金屬對發光細菌聯合毒性研究的報道。本研究選擇甲醛及重金屬Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）為研究對象，通過測定5種物質對發光細菌的急性毒性，利用Weibull函數擬合得到各自的“劑量-效應”曲線，在此基礎上，通過等毒性配比法開展甲醛與4種重金屬的聯合毒性效應研究，并利用DA模型和IA模型對混合體系的聯合毒性進行預測及驗證，旨在為甲醛與重金屬混合體系的聯合作用研究提供基礎數據，并為甲醛與重金屬的環境監管與污染防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥品 甲醛（HCHO）、氯化鎘（CdCl2）、氯化銅（CuCl2）、氯化鉛（PbCl2）、氯化鋅（ZnCl2），均為分析純，試驗用水是利用MW-20B型超純水器（北京盈安美誠科學儀器有限公司生產）制備的。

1.1.2 發光細菌與試驗儀器 毒性試驗儀器使用SDI Microtox Model 500毒性檢測儀（美國AZUR環境有限公司生產）。發光細菌為毒性儀標配的費氏弧菌（Vibrio fischeri）冷凍干粉，儲存在-25 ℃～ -20 ℃的環境中，發光細菌冷凍干粉的復蘇、活化、稀釋等操作參照SDI Microtox Model 500毒性檢測儀標準程序進行。

1.2 方法

1.2.1 單一污染物質對發光細菌急性毒性的測定 甲醛及4種重金屬的半數效應濃度EC50采用毒性檢測儀的81.9% Basic Test模式進行測定。

配制甲醛、Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）初始濃度分別為200.00、200.00、20.00、2.00、20.00 mg/L的溶液。利用毒性儀標配的滲透調節液和稀釋液，等對數間距稀釋得到2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-1010個稀釋度的溶液，共11個濃度梯度，每個濃度均設置3個平行試驗，平行測定結果之間的標準差≤10%。

污染物質對發光細菌的“劑量-效應”曲線整體呈現不規則的“S”形，采用雙參數Weibull函數[4]對污染物質的“劑量-效應”曲線進行非線性擬合：

Weibull函數：E=1-exp{-exp[α+β×log10（C）]}

Weibull反函數：C=10{ln[-ln（1-E）]-α}/β

式中，C為溶液中污染物質的有效濃度（mg/L），E為該濃度時污染物質對發光細菌的發光抑制率，α、β為Weibull函數的擬合參數。

通過Weibull函數擬合，得到5種污染物質對發光細菌的“劑量-效應”曲線及其擬合參數，再利用Weibull反函數計算5種物質的單一毒性EC50。

1.2.2 二元混合物對發光細菌聯合毒性的測定 污染物質對發光細菌的聯合毒性作用比較復雜，兩種物質之間的聯合作用類型往往與混合體系中各組分的濃度配比有關[15]。采用等毒性配比法[16]研究甲醛與四種重金屬的聯合毒性效應。

將“甲醛+Cd（Ⅱ）”、“甲醛+Cu（Ⅱ）”、“甲醛+Pb（Ⅱ）”、“甲醛+Zn（Ⅱ）”四個二元混合體系按照毒性比1∶1配制聯合毒性試驗的11個濃度梯度溶液，測定各混合體系的EC50，測定方法與單一物質相同。其中，梯度溶液的最大濃度為8EC50，1+8EC50，2（EC50，1、EC50，2分別為混合體系中兩種組分各自的單一毒性EC50），再等對數間距稀釋得到濃度分別為4EC50，1 +4EC50，2、2EC50，1+2EC50，2、EC50，1+EC50，2、2-1EC50，1+2-1EC50，2、2-2EC50，1+2-2EC50，2、2-3EC50，1+2-3EC50，2、2-4EC50，1+2-4EC50，2、2-5EC50，1+2-5EC50，2、2-6EC50，1+2-6EC50，2、2-7EC50，1+2-7EC50，2的其他10個濃度梯度溶液，每組混合體系濃度梯度設3個平行試驗，平行測定結果之間的標準差≤10%?；旌象w系聯合毒性效應的EC50是指產生半數效應時，混合體系中的兩種污染物質（甲醛及某種重金屬）的質量濃度之和。

1.2.3 預測方法 應用加和作用（Dose Addition，DA）模型和獨立作用（Independent Action，IA）模型進行預測。

加和作用（DA）是指物質單一毒性的簡單加和，要求混合體系中各物質的毒性作用機理相似，其中的一種物質可以用另一種物質按一定的濃度比例代替。加和作用的數學表達式為：

DA模型：ECxmix=■■-1

式中，ECxi表示第i組分單獨作用時產生效應x的濃度，ECxmix表示產生效應x的混合體系濃度，Pi表示第i組分的濃度占混合體系濃度的比例，n表示混合體系中的組分數。

獨立作用（IA）則適用于毒性作用機理相異的物質，其計算公式為：

IA模型：x=1-■{1-Fi[Pi（ECxmix）]}

式中，x為給定的效應值，ECxmix表示產生效應x的混合體系濃度，Pi表示第i組分的濃度占混合體系濃度的比例，n為混合體系的組分數，Fi表示通過“劑量-效應”函數計算得到第i組分的效應值。

1.2.4 數據處理與分析方法 采用Microsoft Office Excel 2003和Origin 7.5進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 甲醛及4種重金屬對發光細菌的單一毒性

圖1為利用Weibull函數擬合得到的甲醛及4種重金屬的“劑量-效應”曲線。相關統計數據及EC50見表1，R、RMSE分別為擬合值與實測值之間的相關系數、均方根誤差，S為三次平行試驗測定結果間的標準差。表1結果表明，甲醛及重金屬Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）對發光細菌單一毒性的3次平行試驗測定結果之間的標準差分別為2.35%、3.09%、1.38%、2.19%、1.48%，這說明發光細菌法測定物質的急性毒性具有非常高的精確度和穩定性，從而確保了毒性檢測數據的可靠性。應用Weibull函數擬合的甲醛及4種重金屬的效應擬合值與實驗值之間的相關系數R≥0.989，均方根誤差RMSE≤0.058 5，表明Weibull函數可以較好地擬合5種物質對費氏弧菌的“劑量-效應”關系。

毒性物質急性毒性的強弱是用半數效應濃度EC50的大小來表征的，毒性物質的半數效應濃度越小，其急性毒性越強，經過計算，甲醛和重金屬Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）的EC50分別為7.720、11.724、1.040、0.128、0.698 mg/L，5種物質對費氏弧菌的急性毒性具有明顯的差異。其急性毒性的強弱順序為Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、甲醛、Cd（Ⅱ），其中Pb（Ⅱ）對費氏弧菌的急性毒性最強，Cd（Ⅱ）最弱，這與朱麗娜[17]對于重金屬單一毒性的研究結果是一致的。

2.2 甲醛與4種重金屬對發光細菌的聯合毒性

2.2.1 二元混合體系“劑量-效應”曲線的非線性擬合 在單一物質急性毒性試驗的基礎上，根據5種物質的EC50，按照等毒性配比開展甲醛與重金屬混合體系對費氏弧菌的聯合毒性作用研究，并應用Weibull函數模型對混合體系的“劑量-效應”數據進行擬合。表2為二元混合體系的相關統計參數及計算得到的混合體系EC50。由表2可知，二元混合體系“甲醛+Cd（Ⅱ）”、“甲醛+Cu（Ⅱ）”、“甲醛+Pb（Ⅱ）”、“甲醛+Zn（Ⅱ）”聯合毒性的3次平行試驗結果之間的標準差均小于4.50%，表明發光細菌法測定二元混合體系的聯合毒性作用準確、穩定、數據可靠。四個二元混合體系的聯合毒性擬合值與實測值之間的相關系數R≥0.988，均方根誤差RMSE≤0.061 4，表明利用Weibull函數能夠擬合四個二元體系對費氏弧菌的“劑量-效應”關系，并反映二元混合體系的聯合毒性效應。

研究發現，二元混合體系的EC50均比其對應的重金屬單獨作用于發光細菌時的EC50大，但小于對應的重金屬單獨作用EC50與甲醛單獨作用EC50的和。根據EC50可以判斷，四種二元混合體系對發光細菌急性毒性的大小順序為甲醛+Pb（Ⅱ）、甲醛+Cu（Ⅱ）、甲醛+Zn（Ⅱ）、甲醛+Cd（Ⅱ）。

2.2.2 二元混合體系對發光細菌的聯合毒性預測比較 根據DA模型和IA模型對等毒性配比的二元混合體系進行聯合毒性預測，結果如圖2所示。根據擬合得到的Weibull函數計算試驗設置的11個濃度條件下四種二元混合體系對發光細菌的發光抑制率，并與11個濃度條件下分別用DA模型和IA模型預測的發光抑制率進行比較，計算其間的相關系數R和均方根誤差RMSE，結果列于表3。

理論上，不同的混合體系利用DA模型或IA模型得到的預測曲線與實測數據經過擬合得到的“劑量-效應”曲線之間的吻合程度不盡相同，兩種模型預測結果的準確性很大程度上會受到混合體系的聯合效應水平、混合體系中的組分數目、不同組分的濃度比例、單一物質“劑量-效應”曲線的斜率以及使用的擬合回歸函數等因素的影響[18]。

由圖2及表3可知，二元混合體系“甲醛+Cd（Ⅱ）”、“甲醛+Cu（Ⅱ）”、“甲醛+Pb（Ⅱ）”的試驗擬合曲線與DA模型預測曲線或IA模型預測曲線都比較接近；對于這3個二元混合體系，DA模型或IA模型預測值與Weibull函數擬合值之間的相關系數R均大于0.99，均方根誤差RMSE均小于0.05，表明DA模型或IA模型都可以較好地用于這3個二元混合體系聯合毒性的預測。同時利用DA模型和IA模型來預測這3種二元混合體系其中任一種的聯合毒性效應時，發現IA模型得到的R值均大于DA模型，得到的RMSE值均小于DA模型，表明對于這3個二元混合體系聯合毒性的預測，IA模型的預測效果一定程度上要優于DA模型。利用DA模型預測這3個二元混合體系的EC50與Weibull函數擬合的EC50之間的相對偏差分別為19.41%、7.30%、9.85%，利用IA模型預測的3個二元混合體系的EC50與實測擬合的EC50之間的相對偏差分別為16.94%、0.08%、2.14%。

而“甲醛+Zn（Ⅱ）”混合體系的試驗擬合曲線在DA模型預測曲線和IA模型預測曲線的下方，利用DA模型預測的“甲醛+Zn（Ⅱ）”混合體系的EC50與Weibull函數擬合的EC50之間的相對偏差為46.00%，利用IA模型預測其相對偏差則為47.33%，DA模型的預測結果比IA模型更準確，但是，對某一確定濃度的“甲醛+Zn（Ⅱ）”混合體系用DA模型和IA模型預測其對費氏弧菌的毒性（以發光抑制率表征），預測的發光抑制率都明顯大于實測的發光抑制率，預測結果偏高，預測都不夠準確。

本研究只是針對甲醛和重金屬組成的二元混合體系設計了等毒性配比這一種確定濃度比例關系的梯度溶液，探究甲醛與重金屬之間的聯合毒性及作用規律。但是等毒性配比的濃度比例只是反映了混合體系濃度空間分布中的某一個方向，由于混合體系中各物質EC50之間存在線性或非線性關系，即使測定多個濃度比例關系的混合體系聯合效應，也只是反映了濃度空間分布幾個方向的特征，不能說明混合體系全局濃度范圍的聯合作用規律[19]。因此，對于混合體系聯合毒性效應的研究需要借助于更全面、更科學的數學模型或方法。

3 結論

1）基于發光細菌法測定了甲醛及重金屬Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）的急性毒性效應，應用Weibull函數擬合并構建了5種物質各自的“劑量-效應”曲線，得到了5種物質的EC50。甲醛、Cd（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）對費氏弧菌的EC50分別為7.720、11.724、1.040、0.128、0.698 mg/L，5種物質對費氏弧菌的毒性大小順序為Pb（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、甲醛、Cd（Ⅱ）。

2）DA模型和IA模型可以有效地預測二元混合體系“甲醛+Cd（Ⅱ）”、“甲醛+Cu（Ⅱ）”、“甲醛+Pb（Ⅱ）”的聯合毒性效應，IA模型預測效果比DA模型更好；對于混合體系“甲醛+Zn（Ⅱ）”，兩種模型的預測結果都不準確。

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