趨化因子受體CXCR4、PTEN在結(jié)腸黏液腺癌中的表達及臨床意義

張劍虹 張飛 張曉麗 張凡 劉博

·論著·

趨化因子受體CXCR4、PTEN在結(jié)腸黏液腺癌中的表達及臨床意義

張劍虹 張飛 張曉麗 張凡 劉博

目的探討趨化因子受體CXCR4和PTEN蛋白在結(jié)腸黏液腺癌中的表達及其與癌轉(zhuǎn)移及預后的關系。方法采用免疫組織化學及組織芯片技術，檢測25例結(jié)腸正常組織、92例大腸黏液腺癌組織及癌旁組織中PTEN蛋白和趨化因子受體CXCR4的表達情況，并與臨床資料對比分析。結(jié)果PTEN蛋白在結(jié)腸黏液腺癌的表達率為31.52%(29/92)，在癌組織和癌旁組織的表達率明顯低于正常結(jié)腸組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);趨化因子受體CXCR4在結(jié)腸黏液腺癌的表達率為61.95%(57/92)，在癌組織和癌旁組織的表達率明顯高于正常結(jié)腸組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。PTEN蛋白、CXCR4與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(P<0.05)。結(jié)論趨化因子受體CXCR4和PTEN蛋白的過表達與結(jié)腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移相關，且它們在其浸潤轉(zhuǎn)移中具有相關性，常態(tài)化檢測有利與結(jié)腸黏液腺癌的治療。

趨化因子受體；PTEN；組織芯片；結(jié)腸黏液腺癌

結(jié)腸黏液腺癌惡性度高，預后差。它的浸潤和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因。腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移與多種細胞因子有關，趨化因子受體CXCR4和PTEN蛋白對惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移所起的作用越來越受到重視。本文通過檢測92例結(jié)腸黏液腺癌患者及25例正常結(jié)腸組織中CXCR4和PTEN蛋白的表達情況，探討兩者間相互關系及是否與癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移相關，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學院附屬第一醫(yī)院2010至2012年手術切除結(jié)腸黏液腺癌切除石蠟標本92例，結(jié)腸黏液腺癌的診斷標準按WHO腸道腫瘤組織學分型進行，所有樣本切片均經(jīng)組織學證實。其中男47例，女45例；年齡33～69歲，平均51歲；<45歲41例，≥45歲51例；按腫瘤大小分類：≥5 cm 43例，<5 cm 49例；按病理分化程度分類：高分化42例、中低分化50例；浸潤深度至黏膜肌層38例，浸潤深度至漿膜層54例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例、Ⅲ～Ⅳ期47例；所有患者術前均未化療，放療，內(nèi)分泌治療。同時收集結(jié)腸正常組織25例。癌旁組織為距癌組織邊緣大于5 cm處取材。

1.2 組織芯片制備 組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所完成，過程如下：組織載玻片經(jīng)過夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚賴氨酸行防脫片處理，對每一組織標本，觀察HE切片，選取目標組織并在HE切片及其相應石蠟組織塊(供體蠟塊)上標記，萊卡石蠟空白蠟塊(受體蠟塊)與蜂蠟混合(比例為1∶1)，制成2.2 cm×3.5 cm×1 cm大小蠟塊，用加拿大生產(chǎn)CDX718組織芯片儀打孔制成帶孔空白蠟塊，將蠟塊放在39～42℃水浴中軟化后，用組織芯片儀從供體蠟塊標記部位逐個取出直徑1 mm高4 mm的組織柱，推入空白蠟塊預先設計的相應孔內(nèi)，這樣在空白蠟塊上制作完成了68個組織芯片，為防止染色過程中脫片，每例標本上樣四個點，分別安插在空白蠟塊1和2中，對蠟塊進行連續(xù)切片，裱于防脫片處理的載玻片上。

1.3 免疫組織化學方法 即用型CXCR4、PTEN單克隆抗體及SP法免疫組織化學染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物試劑有限公司，組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光鏡分期，采用S-P法，進行免疫組化染色，主要免疫組織化學步驟：石蠟包埋組織切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫下10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；充分水洗，與pH值6.0的檸檬酸緩沖液中高壓鍋處理10 min后，室溫冷卻；非免疫羊血清封閉10 min后，加入即用型鼠單抗CXCR4、PTEN，4℃冰箱過夜，再加入生物素化羊抗鼠IgG和S-P復合物。以DAB液顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片。用TBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 CXCR4蛋白陽性染色分別為細胞膜和(或)細胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果。染色強度評分：無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；高倍鏡(×400)下隨機對每張切片取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞占同類細胞的百分數(shù)：細胞陽性率為0、<25%、25～50%、>50%,分別評為0分、1分、2分、3分。兩種積分乘積<2記為陰性，>2記為陽性。 PTEN陽性表達定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)。陽性反應顯示為出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。腫瘤細胞陽性染色細胞數(shù)≤25%為陰性表達，>25%為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4和PTEN在結(jié)腸黏液腺癌及癌旁組織中的表達 CXCR4在92例結(jié)腸黏液腺癌組織中陽性表達率為61.95%(57/92)，表達部位在細胞膜和(或)細胞質(zhì)中，陽性反應顯示為出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；CXCR4在結(jié)腸黏液腺癌、癌旁組織的陽性表達高于結(jié)腸正常組織，其表達分別為61.95%、40.21%、12.00%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。PTEN在正常結(jié)腸組織，癌旁組織，結(jié)腸癌組織均有不同程度表達，陽性表達定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)。PTEN在結(jié)腸正常組織，癌旁組織、癌組織中的表達率分別為76.00%、45.65%、31.52%。PTEN在結(jié)腸正常組織的表達明顯高于癌旁組織和癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2，表1。

圖1 結(jié)腸黏液腺癌CXCR4的表達(SP×200)

圖2 結(jié)腸黏液腺癌PTEN的表達(SP×200)

表1 CXCR4和PTEN在結(jié)腸黏液腺不同組織中的表達 例(%)

注：與正常組織比較，*P<0.05，#P<0.01

2.2 結(jié)腸黏液腺癌CXCR4和PTEN陽性表達與結(jié)腸黏液腺癌臨床病理因素關系 CXCR4在癌組織浸潤至漿膜組CXCR4的表達高于浸潤至黏膜肌層組；中低分化結(jié)腸黏液腺癌陽性表達高于高分化組；有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸黏液腺癌陽性表達高于無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者組；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸黏液腺癌陽性表達高于Ⅰ～Ⅱ期。兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PTEN在癌組織浸潤至漿膜組PTEN的表達低于浸潤至黏膜肌層組；中低分化結(jié)腸黏液腺癌陽性表達低于高分化組；有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸黏液腺癌陽性表達低于無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者組；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸黏液腺癌陽性表達低于Ⅰ～Ⅱ期；2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CXCR4和PTEN陽性表達率與結(jié)腸黏液腺癌的性別、年齡和腫瘤的大小無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

3 討論

結(jié)腸黏液腺癌是消化道常見的惡性腫瘤，以癌細胞內(nèi)、癌細胞外產(chǎn)生大量黏液為其特點，它侵襲性強，轉(zhuǎn)移率高。預測腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估結(jié)腸黏液腺癌的預后是提高患者生存率的關鍵。

表2 CXCR4和PTEN在結(jié)腸黏液腺癌中的表達與臨床指標的關系 例(%)

注：與對應項目比較，*P<0.05

CXCR4是趨化因子CXCR12的受體，在腫瘤細胞移位、浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[1]，CXCR12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCR12-CXCR4生物學軸(CXCR12-CXCR4 biological axis)是細胞間信息傳遞、細胞遷徙有密切關系的偶聯(lián)分子對，關于CXCR4在腫瘤細胞中的表達各家報道不一，Kodama等[2]發(fā)現(xiàn)子宮頸癌的CXCR4 的表達越高，淋巴結(jié)越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移， CXCR4可以評價患者預后。Yasumoto等[3]發(fā)現(xiàn)有骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移的晚期前列腺癌細胞株中均有CXCR4高表達。本研究將正常結(jié)腸黏膜與癌旁組織、癌組織中的CXCR4表達率相比較，CXCR4在結(jié)腸黏液腺癌、癌旁組織的陽性表達高于結(jié)腸正常組織，說明CXCR4高表達可能與結(jié)腸黏液腺癌的形成和發(fā)展有一定關聯(lián)。癌細胞的病理分級可以反映其惡性程度大小：分化程度越低，則惡性程度越高，本實驗CXCR4在中低分化結(jié)腸黏液腺癌表達高于高分化組；TNM分期能折射出腫瘤進展，分期越高，癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移越容易出現(xiàn)，本實驗CXCR4 在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸黏液腺癌陽性表達高于Ⅰ～Ⅱ期；同時結(jié)腸黏液腺癌浸潤至漿膜的CXCR4表達率明顯高于浸潤至黏膜肌層的病例，而CXCR4的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小無關。由此可見，CXCR4可能促進了結(jié)腸黏液腺癌的浸潤和發(fā)展，在CXCR12-CXCR4生物學軸的作用下，過表達CXCR4的結(jié)腸黏液腺癌逆濃度梯度轉(zhuǎn)移至分泌CXCR12較高的器官，形成器官的特異性轉(zhuǎn)移。這些均表明CXCR12-CXCR4生物學軸可能推進了結(jié)腸黏液腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。目前對其具體作用機制還不十分清楚， 不久將來CXCR4可作為新的腫瘤標記物之一，判斷結(jié)腸黏液腺癌患者的治療及預后。

PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤抑制基因[4]，其通過使PIP3去磷酸化，拮抗了PKB/Akt信號系統(tǒng)，從而阻斷了Akt及其下游激酶的活性，抑制了細胞分裂增殖，誘導細胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用[5]。PTEN在結(jié)腸癌，乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中不表達或低表達，這可能與該基因啟動子甲基化有關。PTEN在癌細胞中表現(xiàn)為雜合性丟失或突變，這種基因突變或雜合性丟失使基因的原有功能發(fā)生改變，細胞不斷增殖，細胞凋亡不被及時誘導，從而導致癌組織的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN在癌旁組織和癌組織的表達低于正常黏膜組織，表明PTEN基因的低表達，不能充分發(fā)揮抑制變異細胞分裂增殖的能力，變異細胞過度生長，導致癌塊形成。本研究還發(fā)現(xiàn)，PTEN隨著分化程度的降低、癌細胞浸潤深度的加深、臨床分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多其表達逐漸減少，表明PTEN抑制了癌瘤的發(fā)生、發(fā)展，啟動子甲基化導致其表達下調(diào)可能為其作用機制，因為PTEN蛋白表達下降或缺失，其抑癌功能下調(diào)，促成結(jié)腸黏液腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。文獻報道，PTEN蛋白降低或減少與人體許多癌瘤有關，并與腫瘤大小，組織學類型、病理分級、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[6]，但本實驗未發(fā)現(xiàn)PTEN的表達與腫瘤大小有關。由此可見PTEN與結(jié)腸黏液腺癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，可為判斷結(jié)腸黏液腺癌的惡性程度及預后提供依據(jù)[7-10]。

PTEN和CXCR4表達有何關聯(lián)，是否存在呈負相關性，有待進一步探討。總之，CXCR4表達上調(diào)和PTEN表達降低或缺失在結(jié)腸黏液腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，對判斷腫瘤的惡性程度和預測預后有指導意義。

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Expressionandclinicalsignificanceofchemokinereceptor-CXCR4,PTENincolonmucinousadenocarcinoma

ZHANGJianhong*,ZHANGFei,ZHANGXiaoli,etal.

*DepartmentofPathology,TheFirstHospitalAffiliatedtoHebeiNorthUniversity,Hebei,Zhangjiakou075029,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of chemokine receptor-CXCR4,PTEN in colon mucinous adenocarcinoma and to explore the correlation between their expression and cancer invasion,metastasis as well as patient’s prognosis.MethodsThe expression levels of PTEN protein and CXCR4 were detected by immunohistochemistry in 20 cases of normal colon tissues,92 cases of colorectal mucinous adenocarcinoma and the tissues beside cancer.The detection results were contrastively analyzed with clinical data.ResultsThe positive expression rate of PTEN protein in colon mucinous adenocarcinoma was 31.52%(29/92),which in cancer tissue and the tissues beside cancer was significantly lower than that in normal colon tissue (P<0.05).The positive expression rate of CXCR4 in colon mucinous adenocarcinoma was 61.95%(57/92),which in cancer tissue and the tissues beside cancer was significantly higher than that in normal colon tissue (P<0.01).The expressions of PTEN protein and CXCR4 were closely correlated to the infiltration depth of cancer,lymph node metastasis and tumor staging(P<0.05).ConclusionThe overexpression of chemokine receptor CXCR4 and PTEN protein are closely related to invasion,metastasis of colon carcinoma,so routine detection of chemokine receptor CXCR4 and PTEN protein is helpful for the treatment of colon mucinous adenocarcinoma.

chemokine receptor;PTEN;tissue chip;colon mucinous adenocarcinoma

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.001

項目來源:張家口市科技局課題(編號:1021091D)

075000 河北省張家口市，河北北方學院附屬第一醫(yī)院病理科(張劍虹、張凡、劉博)，放療科(張飛)；河北北方學院(張曉麗)

張曉麗，075000 河北北方學院；

E-mail:zhangxiaoli1972@163.com

R 365

A

1002-7386(2014)21-3205-04

2014-02-11)