腎綜合征出血熱血漿P-選擇素和組織因子的變化及其與凝血功能紊亂的關(guān)系

俞建家 張東軍 趙宏 袁勁濤 孫志堅

·論著·

腎綜合征出血熱血漿P-選擇素和組織因子的變化及其與凝血功能紊亂的關(guān)系

俞建家 張東軍 趙宏 袁勁濤 孫志堅

目的探討腎綜合征出血熱(HFRS)患者血漿P-選擇素(P-sel)、組織因子(TF)的變化及其與凝血功能紊亂的關(guān)系,以便指導(dǎo)臨床治療。方法27例HFRS患者按病情分為輕癥組和重癥組，輕癥組13例，重癥組14例，分別在不同病期采集抗凝血分離血漿，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測P-sel與TF，血凝固法檢測凝血象，乳膠增強免疫比濁法檢測D-D，自動生化儀檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr),血球分類儀檢測血小板(Pt)參數(shù)；另取20名健康者作對照。結(jié)果在發(fā)熱期，重癥組血漿TF水平顯著高于輕癥組(P<0.01)。血漿P-sel與中性白細胞(PMN)、單核細胞(Mo)之間呈正相關(guān)(df=79，r值分別為0.661與0.513，P<0.01)。TF的變化曲線與APTT、INR、D-D、BUN的變化曲線基本一致，而與Fn、血小板的變化趨勢相反。相關(guān)分析表明血漿TF與APTT、INR、D-D、BUN之間呈正相關(guān)(dg=60，r值分別為0.436、0.351、0.386、0.362，P<0.05),與Pt之間呈負(fù)相關(guān)(df=79，r=-0.405，P<0.01)。結(jié)論HFRS急性期血漿P-sel、TF水平顯著上升，提示體內(nèi)存在內(nèi)皮細胞損傷和血小板活化。血漿P-sel與PMN、Mo呈顯著正相關(guān)，表明P-sel在動員白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用中起重要作用。血漿TF與BUN、APTT、INR、D-D呈正相關(guān)，表明TF之表達增加是引起凝血機制率亂并導(dǎo)致腎功能損害的重要原因。故而強烈建議在病程早期當(dāng)出現(xiàn)DIC或DIC前期表現(xiàn)時宜適當(dāng)應(yīng)用低分子肝素等抗凝劑治療。

腎綜合征出血熱；P-選擇素；組織因子；D-二聚體；凝血象

腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由漢坦病毒引起的急性傳染病,鼠類為主要傳源，流行于歐亞地區(qū)30多個國家[1],我國受害最為嚴(yán)重,患病人數(shù)占世界總發(fā)病人數(shù)的90%左右。本病的基本病理變化是全身廣泛性毛細血管損傷[2]，臨床上出現(xiàn)發(fā)熱、出血、血漿外滲和多器官損害。已知組織因子(TF)是外凝血途徑的啟動因子，P-選擇素(P-sel)則參與血小板聚集以及白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用，它們在HFRS發(fā)病機制中的作用尚少報道，本文著重探討P-sel、TF與凝血功能紊亂的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 研究對象為2010年1月至2011年12月丹陽市人民醫(yī)院收治的27例HFRS患者，均符合1997年衛(wèi)生部頒布的流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)血清學(xué)檢查HFRS特異性IgM陽性而確診。其中男17例，女10例；年齡22～72歲，平均年齡50歲。大多在發(fā)熱期入院，少數(shù)在低血壓、少尿期入院；平均入院病日為(4.2±1.5)d。按病情分型：輕型2例，中型11例，重型12例，危重型2例。為便于統(tǒng)計和比較，將輕型與中型合并為輕癥組，重型與危重型合并為重癥組；同時因低血壓期持續(xù)短暫，又常與少尿期重疊，故將此二期合并統(tǒng)計；另取20名健康成人作對照組。

1．2 研究方法

1．2．1 血漿P-sel、組織因子(TF)檢測：按病期采集抗凝血，分離血漿后置-80℃?zhèn)錂z；二者皆用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測，試劑盒購自上海活樂生物技術(shù)有限公司。

1．2．2 凝血象用血凝固法檢測，血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)用自動血細胞分析儀檢測，D-二聚體(D-D)用乳膠增強免疫比濁法檢測。

1．2．3 血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)檢測：采用自動生化分析儀檢測。

1．2．4 治療方法：所有患者均給予液體療法為主的對癥治療； 6病日以內(nèi)入院的患者尚給予病毒唑500 mg加入輸液中緩慢靜滴，2次/d，或普通干擾素α2b 300萬U 皮下注射，1次/d，療程各為3～5 d。

2 結(jié)果

2．1 血漿P-sel的變化 發(fā)熱期和低血壓少尿期血漿P-sel顯著高于恢復(fù)期和對照組水平(P<0.05)，在發(fā)熱期、重癥組顯著高于輕癥組(P<0.05),多尿期以后兩組皆逐漸降至正常水平。血漿P-sel與TF之間呈顯著正相關(guān)(df=60，r=0.599，P<0.01)，與WBC、PMN、Mo之間也呈正相關(guān)(df=79，r值分別為0.644、0.661與0.513，P<0.01)，P-sel的變化曲線與WBC、PMN、Mo的變化趨勢大體一致。見表1、圖1。

2．2 血漿TF的變化 發(fā)熱期與低血壓少尿期血漿TF顯著高于恢復(fù)期和對照組水平(P<0.01)，重癥組顯著高于輕癥組(P<0.01)。TF與BUN、APTT、INR、D-D之間呈顯著正相關(guān)(df=60，r值分別為0.436、0.351、0.386、0.362，P<0.01),與外周血Pt之間呈顯著負(fù)相關(guān)(df=79，r=-0.405，P<0.01)。見表1、圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05,#P<0.01；與恢復(fù)期比較，△P<0.05，☆P<0.01；與輕癥組比較，▲P<0.05，★P<0.01

圖1 HFRS重癥組血漿P-sel、WBC(×109/L)、Mo(×1010/L)水平的動態(tài)變化

F:發(fā)熱期,HO:低血壓少尿期,P:多尿期,C:恢復(fù)期

圖2 HFRS重癥組血漿TF、APTT、BUN水平的動態(tài)變化

表2 HFRS患者凝血像和Pt參數(shù)的動態(tài)變化

注：與對照組比較，*P<0.05,#P<0.01；與恢復(fù)期比較，△P<0.05，☆P<0.01；與輕癥組比較，▲P<0.05,★P<0.01

2．3 凝血像的變化 發(fā)熱期與低血壓少尿期血漿APTT、INR、D-D均顯著升高，與恢復(fù)期和對照組相比P<0.01；在發(fā)熱期重癥組與輕癥組之間也有統(tǒng)計學(xué)差異，重癥組顯著高于輕癥組水平(P<0.05)。血漿Fn則與之相反，重癥組前三期顯著減低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但輕癥組僅在低血壓少尿期顯著下降，其他各期下降均不明顯。APTT、INR的變化曲線與TF、BUN的變化曲線基本一致。見表2、圖2。

2．4 血小板參數(shù)的變化 病程早期血小板進行性減少，至低血壓少尿期下降至低谷，重癥組比輕癥組下降更明顯，多尿期以后逐漸回升。在血小板減低的同時，MPV則逐漸增大，隨著血小板計數(shù)的上升，MPV也漸漸減小，但重癥組恢復(fù)較遲，Pt與MPV之間呈負(fù)相關(guān)(df=79，r=-0.394，P<0.01)；Pt的變化曲線與APTT、INR、D-D的變化趨勢相反。見表2。

2．5 血漿D-二聚體的變化 病程各期血漿D-D水平均見增高，和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；低血壓少尿期輕、重二組之間也有統(tǒng)計學(xué)差異，重癥組高于輕癥組(P<0.05)；多尿期以后D-D水平漸有下降，但直到恢復(fù)初期仍未降至正常范圍。見表2。

2．6 血清BUN、Cr的變化 發(fā)熱后期BUN和Cr開始升高，少尿期達到高峰，多尿期以后逐漸復(fù)常，重癥組BUN和Cr峰值明顯高于輕癥組(P<0.01)。

3 討論

致病性漢坦病毒可引起兩種臨床綜合征，一為腎綜合征出血熱，主要流行于亞洲和歐洲一些國家，另一為漢坦病毒肺綜合征(HPS)，主要流行于美洲部份國家，二者病原體分屬漢坦病毒的不同亞型。研究表明，漢坦病毒對體外培養(yǎng)的細胞并無直接致病變效應(yīng)(CPE)，而感染后的免疫炎性反應(yīng)與發(fā)病機制有很大關(guān)聯(lián)[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)漢坦病毒能抑制αVβ3-整合素對血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的調(diào)節(jié)功能[4]，破壞內(nèi)皮細胞間的緊密連接[5]，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞通透性增加，本研究顯示血漿P-sel、TF顯著升高，便是內(nèi)皮細胞損傷的重要標(biāo)志。

P-sel是一種黏附分子，儲存于內(nèi)皮細胞Weibel-Palade小體和血小板α顆粒內(nèi)，靜止血小板和內(nèi)皮細胞表面通常不表達P-sel，但在炎性介質(zhì)、凝血酶、氧自由基等刺激后可迅速表達，故血漿P-sel增加也意味著血小板與內(nèi)皮細胞已被激活。P-sel的主要功能是參與細胞間黏附和信號交流，但它必須與配體結(jié)合后方能發(fā)揮其功能，SGL-1是P-sel的主要配體。內(nèi)皮細胞表達的PSGL-1與血小板表達的P-sel結(jié)合后可導(dǎo)致血小板黏附于內(nèi)皮細胞；白細胞表達的PSGL-1與內(nèi)皮細胞表達的P-sel結(jié)合后可使得白細胞在內(nèi)皮細胞表面滾動黏附；這種血小板-內(nèi)皮細胞-白細胞之間的相互作用可使細胞外信號向內(nèi)傳導(dǎo)，相互誘導(dǎo)活化、表達或釋放各自特有的細胞因子參與凝血和炎性反應(yīng)[6]。例如血小板可表達αⅡbβ3等黏附分子，使其聚集在血管損傷部位，形成穩(wěn)固的血小板栓[7]；單核細胞可釋放TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子，引起全身炎性反應(yīng)[8]；內(nèi)皮細胞可表達ICAM-1、E-sel，白細胞可表達L-sel、β2-整合素[9]，使白細胞穩(wěn)定地黏附于內(nèi)皮細胞并進而跨內(nèi)皮移行，加重內(nèi)皮細胞的炎癥和損傷。本研究顯示P-sel與WBC、PMN、Mo之間呈顯著正相關(guān)，也說明P-sel在白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用中起重要作用。

小血管損傷后暴露的組織因子可啟動外凝血途徑，TF相繼激活FⅦ、FⅩ，形成TF-FⅦ/FⅦa-FⅩa復(fù)合物，在Ca2+參與下激活凝血酶元(FⅡ)，生成少量的凝血酶(Ⅱa)，完成凝血過程的初步階段[10]。此后，凝血酶再激活血小板和內(nèi)凝血途徑的相關(guān)因子，啟動內(nèi)凝血途徑和凝血共同途徑，從而進入凝血放大階段，此時如沒有足量的抗凝血酶、組織因子途徑抑制物(TFPI)等抗凝物質(zhì)存在，將會產(chǎn)生彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)[11]。本研究顯示HFRS急性期血漿TF顯著升高，強烈提示這一時期存在著高凝狀態(tài)。

內(nèi)皮細胞、單核細胞、血小板等受到腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β、血管緊張素-Ⅱ(AT-Ⅱ)、凝血酶等刺激后能迅速表達TF，并通過起泡方式脫落于血液中，形成可溶性富含TF微粒，參與凝血過程[12]。我們以往的研究證明HFRS病程中血漿AT-Ⅱ、TNF-α、IL-1β均顯著增加，這可能是導(dǎo)致血漿TF水平升高的重要原因。

血漿TF與HFRS病情明顯相關(guān)，重癥組TF水平顯著高于輕癥組，而且TF與BUN、APTT、INR之間呈顯著正相關(guān),與血小板計數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，說明TF水平可反映病情之輕重。

凝血的最后階段是形成纖維蛋白。纖維蛋白原(Fg)受凝血酶作用后釋出纖維蛋白肽A和肽B，形成可溶性纖維蛋白單體,后者經(jīng)FⅩⅢ作用后互相交聯(lián)，形成不溶性纖維蛋白，最后在纖溶酶作用下產(chǎn)生各種纖維蛋白降解片段(FDP)，其中含有γ鏈的兩個交聯(lián)的D片段就稱為D-二聚體(D-D)。非交聯(lián)的纖維蛋白和纖維蛋白原受纖溶酶作用后雖也能產(chǎn)生FDP,但不能形成交聯(lián)的D-D,故D-D的檢出既反映了凝血系統(tǒng)的激活，又反映了繼發(fā)性纖溶的存在。HFRS急性期血漿D-D顯著高于對照組水平，低血壓少尿期尤為明顯，說明凝血酶與纖溶酶均巳激活[13]。

血小板在止凝血過程中起著舉足輕重的作用[9]，廣泛性毛細血管損傷必然引起大量血小板聚集，這可能是本病早期血小板減少的最主要原因，多尿期以后損傷小血管逐漸修復(fù)，故而血小板逐漸回升。血小板變化曲線與APTT、INR、D-D的變化趨勢相反，也佐證了血小板在凝血中的消耗。此外，也有人提出漢坦病毒對骨髓巨核細胞的攻擊以及免疫復(fù)合物沉積于血小板表面激活補體也可能與血小板減少有關(guān)[14]。

血小板減少的同時，MPV也明顯增大，這反映了骨髓巨核細胞代償性釋放幼稚血小板的速率增加，新生的幼稚血小板黏附性較強，易發(fā)生釋放反應(yīng)，更有利于微血栓形成，這與病程早期APTT和D-D的變化相一致。

綜上所述，HFRS患者血漿P-sel與TF含量增加是內(nèi)皮細胞廣泛性損傷的顯著標(biāo)志，與病情輕重有密切聯(lián)系。血漿P-sel水平與白細胞計數(shù)(包括中性粒細胞和單核細胞)呈顯著正相關(guān)，表明P-sel在動員白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用中起重要作用。血漿TF含量不僅與APTT、INR、D-D呈顯著正相關(guān)，而且與BUN也顯著相關(guān)，這表明TF是引起凝血機制紊亂和腎功能損害的重要原因。由此可見，在病程早期當(dāng)出現(xiàn)DIC前期表現(xiàn)，如皮膚瘀點、瘀斑、頑固性休克、多器官功能障礙、血液呈高凝狀態(tài)、血漿TF增高時，宜應(yīng)用低分子肝素、重組人活化蛋白C或低分子右旋糖酐等抗凝劑治療，以便改善微循環(huán)，提高抗休克治療的成功率。

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ThechangesofP-selectinandtissuefactorinhemorrhagicfeverwithrenalsyndromeandthecorrelationbetweenthechangesandbloodcoagulationfunctiondisorder

YUJianjia,ZHANGDongjun,ZHAOHong,etal.DanyangMunicipalPeople’sHospital,Jiangsu,Danyang212300,China

ObjectiveTo investigate the changes of P-selectin (P-sel) and tissue factor (TF) in hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and the correlation between the changes and blood coagulation function disorder,so as to direct clinical treatment.MethodsTwenty-seven patients with HFRS were divided into two groups according to the severity of illness,mild case group (n=13) and severe case group (n=14),and 20 healthy subjects were served as control group.The levels of plasma P-sel and TF were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),coagulogram was measured by immunoturbidimetry,blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) were detected by automatic biochemical analyzer,and platelet parameters were determined by automatic blood cell classification analyzer for both groups.ResultsIn pyretogenic stage of HFRS,the plasma levels of TF in severe case group were significantly higher than those of mild case group (P<0.01).The plasma levels of P-sel were positively correlated to those of polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes (mo) (r=0.661,0.513,P<0.01).The change curve of TF was basically coincident with that of APTT,INR,D-D,BUN,however,which was opposite to that of Fn,platelet.The correlation analysis showed that the plasma levels of TF were positively correlated to those of APTT,INR,D-D,BUN (r=0.436,0.351,0.386,0.362,respectively,P<0.05),however,which were negatively correlated to those of Pt (r=-0.405,P<0.01).ConclusionThe plasma P-sel plays an important role in promoting the interaction between white blood cell and endothelial cells.The increase of TF expression is the important reason of causing clotting mechanism disorder and resulting in renal function lesion.

hemorrhagic fever with renal syndrome;P-selectin;tissue factor;D-dimer;coagulogram

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.002

212300 江蘇省丹陽市人民醫(yī)院(俞建家、張東軍、趙宏、袁勁濤)；江蘇省人民醫(yī)院(孫志堅)

孫志堅，210029 江蘇省人民醫(yī)院；

E-mail：njsunzj@163.com

R 512.81

A

1002-7386(2014)04-0488-04

2013-08-02)