MMP-9和咬合蛋白在彌漫性腦損傷大鼠皮層的表達變化及與腦水腫的關系

趙軼群 王麗娜 劉永亮 王鵬

·論著·

MMP-9和咬合蛋白在彌漫性腦損傷大鼠皮層的表達變化及與腦水腫的關系

趙軼群 王麗娜 劉永亮 王鵬

目的觀察彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及損傷區皮層MMP-9和咬合蛋白表達的變化。方法成年健康SD雄性大鼠160只,按隨機數字表法分為對照組(n=60)和模型組(n=100)。應用Marmarou’s法建立彌漫性腦損傷大鼠模型。2組分別于術后3、12、24、72、144 h行干濕重法檢測2組大鼠腦組織含水量變化，行免疫組化和Western blot檢測損傷區周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達水平。對各結果進行相關性分析。結果與對照組比較，模型組各時間點大鼠腦組織含水量明顯增加，腦組織損傷區周圍皮層MMP-9表達明顯增高(P<0.05)，咬合蛋白表達明顯降低(P<0.05)。腦組織含水量變化與MMP-9表達變化呈正相關(P<0.05)，腦組織含水量變化與咬合蛋白表達變化呈負相關(P<0.05)，MMP-9蛋白表達變化與咬合蛋白表達變化呈負相關(P<0.05)。結論彌漫性腦損傷發生后損傷區皮層MMP-9蛋白表達明顯增加，咬合蛋白表達明顯降低，腦水腫形成。MMP-9表達的增加，導致了咬合蛋白破壞，腦水腫形成。

彌漫性腦損傷；腦水腫；基質金屬蛋白酶-9；咬合蛋白

腦水腫是顱腦創傷發生后主要的病理生理過程之一，可引起顱內壓增高，明顯加重顱腦創傷的病理損害。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一種Zn2+依賴性蛋白酶，可攻擊腦血管外基膜的層黏蛋白和纖粘蛋白，破壞血腦屏障，與腦水腫形成密切相關。咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要組成部分之一。有關彌漫性腦創傷大鼠腦水腫和皮層MMP-9、咬合蛋白表達之間的關系尚未見臨床報道。本研究采用Marmarou’s[1]法制造彌漫性腦創傷大鼠模型，觀察MMP-9和咬合蛋白表達變化與腦水腫形成之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組 成年SD雄性大鼠160只，清潔級,平均體重(300±20)g，購自北京維通利華公司(合格證：SCXK(京)2002-003)，于河北聯合大學動物實驗中心，在常溫下常規飼料喂養。所有動物實驗遵循國際生命指導中心關心和使用動物實驗原則。按隨機數字表法分為對照組(n=60)和模型組(n=100)。

1.2 模型制備 參考Marmamu法[1]制作大鼠彌漫性腦創傷模型：乙醚麻醉動物(麻醉時間約為70～150 s)，將麻醉好的大鼠俯臥位固定于海面床墊(10 cm×20 cm×30 cm)上，將質量450 g、直徑18 mm的銅棒自1.5 m高度垂直落下撞擊置于大鼠冠狀縫與失狀縫正中的不銹鋼墊，造成大鼠彌漫性顱腦創傷模型。正常對照組動物只進行乙醚麻醉而不致傷。在模型制作過程中死亡32只，給予補充。

1.3 腦組織含水量測定 隨機選取2組各時間點大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從損傷區周圍取200 mg左右的腦組織，采用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕重并記錄后置于105℃恒溫干燥箱內干燥48 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計算腦含水量：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 免疫組化檢測腦損傷周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達變化 隨機選取2組各時間點大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后開胸,4%多聚甲醛灌注,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱過夜至組織塊沉底。冠狀切取2 mm厚包含損傷區域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。經自來水沖洗48 h，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊取出放入切片機中做連續切片,片厚5 μm。

取各大鼠等部位切片3張，經二甲苯二級脫蠟各5 min，梯度乙醇脫水，3%H2O2溶液室溫10 min，以消除內源性過氧化物酶，高壓熱修復，后滴加1∶100比例稀釋的咬合蛋白一抗(武漢博士德生物工程有限公司)4℃過夜，次晨取出置常溫，PBS緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，包漿黃染。在400×顯微鏡下在傷灶周圍隨機選取5個視野，用美國Media Cybernetics公司生產的Image-Pro-Plus圖像分析系統照相后計算每個視野中陽性細胞數目。

1.5 Western blot 檢測腦損傷周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達變化 用細胞裂解液提取各組各時間點大鼠損傷區周圍腦組織總蛋白，運用考馬斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100 μg蛋白。進行15%SDS-PAGE凝膠電泳，NC轉膜，5%脫脂奶粉封閉；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000稀釋)、山羊抗咬合蛋白(rI’11r18/serl9)多克隆一抗(1∶1 000稀釋) 、山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)進行雜交。EcL發光劑3 min，曝光、顯影、定影。采用數碼成像分析系統軟件分析Westem blot結果平均灰度值，以目標的平均灰度值比內參的平均灰度值比值的大小作為分析對象進行比較。

1.6 相關性分析 采用線性相關分析法分別對腦組織含水量變化與MMP-9免疫組化結果、腦組織含水量與咬合蛋白免疫組化結果、腦組織含水量與MMP-9 Western blot結果、腦組織含水量與咬合蛋白Western blot結果進行相關性分析。

2 結果

2.1 腦組織含水量測定 對照組各時間點腦組織含水量無明顯差異。與對照組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯增高(P<0.05)。其中3 h腦組織含水量開始增加，12 h繼續增加，24 h達到高峰，72 h腦組織含水量開始降低，144 h腦組織含水量明顯降低。見表1。

組別3h12h24h72h144h對照組71．67±0．2771．76±0．2271．70±0．2671．81±0．0971．73±0．28模型組74．16±0．2375．54±0．2479．30±0．2778．05±0．2573．10±0．17F值246．23660．972068．872744．3785．86P值0．000．000．000．000．00

2.2 MMP-9免疫組合結果 對照組可見一定量被染成棕黃色的陽性細胞，胞膜表達，各時間點陽性細胞數無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，模型組大鼠損傷區周圍陽性細胞數明顯增多(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9陽性細胞數即開始增多，24 h達到高峰，72 h開始減少，144 h明顯減少。見表2。

組別3h12h24h72h144h對照組19．4±2．319．6±2．720．2±4．021．0±2．820．0±2．4模型組28．6±2．755．4±3．2111．8±3．075．8±2．927．4±3．2F值33．59364．101719．38926．8617．33P值0．000．000．000．000．00

2.3 咬合蛋白免疫組化結果 對照組可見一定量被染成棕黃色的陽性細胞，細胞核表達，各時間點陽性細胞數無明顯差異。與對照組比較，模型組大鼠損傷區周圍陽性細胞數明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白陽性細胞數開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表3。

組別6h12h24h72h144h對照組38．4±1．538．2±1．938．6±1．738．8±0．438．2±0．8模型組29．8±0．417．2±2．610．0±2．615．6±1．130．8±3．0F值147．92212．02417．33326．2129．13P值0．000．000．000．000．00

2.4 MMP-9 western blot結果 對照組各時間點蛋白含量無明顯差異。與對照組比較，模型組大鼠損傷區腦組織咬合蛋白含量明顯增加(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表4，圖1。

組別3h12h24h72h144h對照組0．175±0．0090．172±0．0090．173±0．0090．175±0．0090．177±0．007模型組0．290±0．0110．480±0．0090．775±0．0060．654±0．0050．346±0．005F值323．083088．2414986．6511733．221894．14P值0．000．000．000．000．00

2.5 咬合蛋白 Western blot 結果 對照組各時間點蛋白含量無明顯差異。與對照組比較，模型組大鼠損傷區腦組織咬合蛋白含量明顯增加(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表5，圖1。

組別6h12h24h72h144h對照組2．2544±0．00772．2560±0．00842．2550±0．00702．2551±0．00812．2555±0．0092模型組1．8687±0．00711．7034±0．00691．4626±0．00811．6450±0．00611．9703±0．0061F值6790．9812760．7627501．8018175．213320．80P值0．000．000．000．000．00

1A：MMP-9在對照組各時相點的表達，其在各時相點的表達無明顯差異；1B：MMP-9在模型組各時相點的表達，其在造模成功后3 h(第1個條帶)開始增加，24 h(第3個條帶)達高峰，72 h開始減少(第4個條帶)，144 h(第5個條帶)明顯減少；1C：occludin在對照組各時相點的表達，其在各時相點的表達無明顯差異；1D：occludin在模型組各時相點的表達，其在造模成功后3 h(第1個條帶)開始減少，24 h(第3個條帶)減少最明顯，72 h開始恢復(第4個條帶)，144 h(第5個條帶)明顯恢復；1E：內參，內參在各組各時間點的表達無變化。

圖4 損傷周圍腦組織咬合蛋白表達

2.6 相關性分析結果 (1)傷后各時間點腦組織含水量變化與MMP-9免疫組化結果呈正相關(r=0.962，P<0.05)。(2)傷后各時間點腦組織含水量變化與咬合蛋白免疫組化結果呈負相關(r=-0.904，P<0.05)。(3)傷后各時間點腦組織含水量變化與MMP-9 Western blot結果呈正相關(r=0.904，P<0.05)。(4)傷后各時間點腦組織含水量變化與咬合蛋白Western blot結果呈負相關(r=-0.966，P<0.05)。(5)傷后各時間點MMP-9免疫組化結果與咬合蛋白免疫組化結果呈負相關(r=-0.915，P<0.05)。(6)傷后各時間點MMP-9 Western blot結果與咬合蛋白Western blot結果呈負相關(r=-0.940，P<0.05)。

3 討論

腦水腫是顱腦創傷發生后的主要繼發性病理過程。本研究應用干濕重法檢測彌漫性腦創傷大鼠腦組織含水量的變化提示傷后3 h腦水腫即開始形成，24 h達到高峰，72 h開始緩解，144 h腦水腫明顯緩解，與以往學者研究結果大致相符。有關腦創傷后腦水腫的形成機制包括腦出血、微循環障礙、炎癥反應、自由基損傷、鈣超載、血腦屏障破壞等[2]。而有關MMP-9和咬合蛋白對腦創傷后腦水腫的影響尚未見臨床報道。

基質金屬蛋白酶是一組調節細胞外基質成分的Zn2+依賴性重要蛋白酶。MMP-9是基質金屬蛋白酶的一類，主要存在于腦組織的海馬、皮質和紋狀體中，但正常情況下含量很少[3]。正常情況下，MMP-9以酶原的形式存在，MMP-9酶原被激活后迅速被降解，以防其過度活化[4]。本研究采用免疫組化和Western blot檢測腦創傷大鼠皮層MMP-9蛋白表達的變化提示傷后3 h損傷區皮層MMP-9表達即開始增加，24 h達高峰，72 h開始降低，144 h MMP-9表達量明顯降低。相關性分析提示傷后腦水腫變化與MMP-9表達變化呈正相關，提示MMP-9參與了腦水腫的形成。Gidday等[5]發現白細胞，特別是中性粒細胞是腦梗死后MMP-9的來源。而MMPs的基因表達受以下三方面的調控：(1)MMPs基因表達受細胞因子(IL-1、IL-6等)、生長因子(VEGF、FGF)、蛋白激酶、糖皮質激素等調控；(2)MMP-9酶原需要被MMP-3、纖溶酶及纖溶酶原激活物、NO等激活為有活性的MMP-9[6]；(3)血漿中的α2巨球蛋白能抑制MMP-9的活性。所以我們認為當腦創傷發生時可繼發炎癥反應，導致中性粒細胞數目增高，MMP-9產生增多。此外顱腦創傷后炎性因子TNF、IL-1、IL-6等表達增加，進而激活MMP-9，發揮其生物學活性，導致腦水腫的形成。

咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要成分，與腦水腫形成的關系密切。本研究應用免疫組化和Western blot對大鼠腦創傷后皮層咬合蛋白的表達進行研究發現：彌漫性腦損傷后3 h咬合蛋白表達開始減少，24 h減少最明顯，72 h后開始增加，144 h后損傷區咬合蛋白含量明顯增加。相關性分析結果提示腦水腫與皮層咬合蛋白表達變化呈負相關,且為顯著相關。提示咬合蛋白的破壞與腦水腫的形成密切相關。Yu等[7]研究表明，當咬合蛋白表達下降時，緊密連接功能受損，對離子的通透性增加，證明咬合蛋白對維持緊密連接的正常功能有非常重要的作用。MMP-9與咬合蛋白表達變化相關性分析提示兩者呈負相關，顯著相關。而且MMP-9和咬合蛋白均與腦水腫的形成密切相關，我們認為腦創傷發生后通過炎癥反應等激活MMP-9，而MMP-9降解了咬合蛋白，導致緊密連接破壞，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重。

1 Marmarou A，Foda MA，van den Brink W，et al．A new model of diffuse brain injury in rats.Part I：Pathophysiology and biomechanics.Neurosurg,1994,80：291-300．

2 劉永亮，王鵬，李建民.腦損傷后腦水腫的發病機制研究進展.中國醫藥指南，2013,11：76-78.

3 Wagner S,Nagel S,Kluge B,et al.Topographically graded postischemic presence of metalloproteinases is inhibited by hypothermia.Brain Res,2003,984:63-75.

4 Yu Q,Stamenkovic I.Localization of metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44-mediated tumor invasion.Genes Dev,1999,13:35-48.

5 Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al．Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289：558-568.

6 Dzwonek J,Rylski M,Kaczmarek L.Matrix Metedloproteinases and their endogenous inhibitors in neuronal physiology of the adult brain.FEBS Lett,2004,67:129.

7 Yu AS,Mc Carthy KM,Francis SA,et al.Knockdown of occluding expression leads to diverse phenotypic alterations in epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol,2005,288:C1231-C1241.

ThechangesofexpressionofMMP-9andoccludininbraincortexofratswithdiffusebraininjuryandthecorrelationbetweenthechangesandbrainedema

ZHAOYiqun*,WANGLina,LIUYongliang,etal.*TheTenthHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the changes of expression of MMP-9 and occludin in brain cortex of rats with diffuse brain injury and the changes of brain edema around injury region.MethodsThe 160 Sprague-Dawley adult male rats were randomly divided into control group (n=60) and model group (n=100).The animal models with diffuse brain injury were established in rats by means of Marmarou’s method.At 3h,12h,24h,72h and 144h after injury,brain water content was detected by dry wet weight measurement method in both groups,and the expression levels of MMP-9 and occludin around the injury area were measured by immunohistochemistry and Western Blot.Finally the correlation analysis was performed about these results.ResultsAs compared with that in control group,the brain water content in model group was significantly increased in different time points,and the expression levels of MMP-9 around injury area were obviously increased (P<0.05),however,the content of occludin was significantly decreased.The changes of brain water content were positively correlated to those of MMP-9 (P<0.05).However the changes of brain water content were negatively correlated to those of occludin expression levels (P<0.05),so were between MMP-9 expression and occludin expression.ConclusionAfter the diffuse traumatic brain injury,the expression levels of MMP-9 in brain cortex around injury area are obviously increased,however,the expression levels of occluding are significantly decreased,and brain edema appears.The increase of MMP-9 expression levels results in the decrease of occludin expression levels,as a result,brain edema occurs.

diffuse brain injury;brain edema;MMP-9;occludin

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.004

063000 河北省唐山市第十醫院(趙軼群)；河北省唐山市人民醫院(王麗娜)；河北聯合大學(劉永亮、王鵬)

R 651.1

A

1002-7386(2014)04-0495-04

2013-09-07)