卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表達及意義

程佳 楊曉龍 尋志杰 張彩英 司華鵬 彭志美 于華 霍艷

·論著·

卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表達及意義

程佳 楊曉龍 尋志杰 張彩英 司華鵬 彭志美 于華 霍艷

目的探討磷酸化AKT(p-AKT)、3-羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)與張力蛋白同源的第10染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)在卵巢上皮性癌中的表達，分析它們之間的關系及其與卵巢上皮性癌患者預后的關系。方法應用免疫組織化學方法，檢測10例正常卵巢組織，20例卵巢良性上皮性腫瘤，60例卵巢上皮性癌組織中p-AKT、PI3K和PTEN的表達。結果P-AKT和PI3K在正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤中的陽性表達顯著低于卵巢上皮性癌組織，而PTEN蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達顯著低于正常卵巢組織、良性上皮性腫瘤(P均<0.01)。P-AKT、PI3K和PTEN表達與臨床分期、病理分級、是否存在淋巴結轉移及遠處轉移有關(P<0.01)，與年齡、病理類型及是否伴有腹水無關(P>0.05)。P-AKT和PI3K在卵巢上皮性癌中的表達呈正相關(r=0.552，P<0.01)，P-AKT和PTEN卵巢上皮性癌中的表達呈負相關(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN卵巢上皮性癌中的表達呈負相關(r=-0.535，P<0.01)。結論P-AKT、PI3K的過表達伴隨PTEN表達缺失參與卵巢上皮性癌的發生發展。

卵巢腫瘤；AKT；PTEN；PI3K；免疫組織化學

卵巢癌的發病率在女性生殖器官惡性腫瘤中位居第三位，但其致死率卻占婦科腫瘤的首位，至今對于卵巢癌的發生機制仍不完全清楚。近年來信號傳導通路與腫瘤的發生、發展、治療及轉歸中的作用已經成為研究的熱點。3羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號傳導通路參與細胞生長、增殖、分化調節，與多種腫瘤細胞的惡性行為有關[1]。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)全稱是與張力蛋白同源在10號染色體有缺失的磷酸酶基因。磷酸化和去磷酸化是調節細胞活動的重要方式，許多癌基因的產物都是通過磷酸化而刺激細胞生長。PTEN可能通過去磷酸化參與細胞調控。PTEN通過抑制PI3K/AKT通路，在腫瘤的發生、發展中起重要作用。本研究應用免疫組化方法探討p-AKT、PI3K與PTEN在卵巢上皮性癌組織中的表達，分析它們之間的關系及其與卵巢上皮性癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年10月至2010年12月邯鄲市第一醫院住院患者存檔的90份蠟塊，包括正常卵巢組織10份(正常組)，卵巢良性上皮腫瘤組織20份(良性組)，卵巢上皮癌組織60份(卵巢癌組)。正常組患者年齡22～58歲，中位年齡40歲；良性組患者年齡20～50歲，中位年齡35歲；卵巢癌組年齡35～75歲，中位年齡55歲。3組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。卵巢癌病理分級：G1 18例，G2 15例，G3 27例；按國際婦產科聯盟(FIGO，1988年)標準進行手術病理分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期38例。

1.2 主要試劑 兔抗人p-AKT多克隆抗體，兔抗人PI3K多克隆抗體，購自Cell Signaling Technology公司。兔抗人PTEN多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。DAB顯色劑、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素標記盒(SP)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 染色方法及結果判斷標準 通過免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法對p-AKT、PI3K、PTEN蛋白的表達進行觀察。染色設陰性及陽性對照。陰性對照使用磷酸鹽緩沖液代替一抗，取p-AKT、PI3K、PTEN表達陽性的乳腺癌組織的石蠟切片作為陽性對照。結果判斷標準：(1)據陽性細胞比例：光學顯微鏡下選取5個視野，每個視野隨機選取100個細胞，計算陽性細胞數占總細胞數的比例作為陽性細胞比例，取平均值。①陽性細胞≤10%評1分；②陽性細胞為10%～50%評2分；③陽性細胞為51%～74%評3分；④陽性細胞≥75%評4分。(2)據陽性細胞染色強度：細胞不顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。陽性細胞比例乘以細胞染色強度積分為每例標本得分，范圍為0～12分，其中0分為(-)，1～4分(﹢)，5～8分為(﹢﹢)，9～12分為(﹢﹢﹢)。陽性表達率的計算方法為陽性表達細胞數/總細胞數×100%。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，相關性應用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-AKT、PI3K和PTEN在卵巢組織中的表達 卵巢上皮癌組織中p-AKT和PI3K的陽性表達率顯著高于卵巢正常組織和良性組織(P<0.05)，卵巢正常組織與卵巢良性組織間的差異無統計學意義(P>0.05)。卵巢上皮癌組織中PTEN的陽性表達率顯著低于卵巢正常組織和良性組織(P<0.05)，卵巢正常組織與卵巢良性組織間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常卵巢、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN的表達 例(%)

注：與卵巢癌組比較,*P<0.01

2.2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白與卵巢癌臨床參數的關系 p-AKT、PI3K和PTEN的表達與卵巢上皮癌手術病理分期、病理分級有關 (P<0.05)，而與年齡、病理類型無關(P>0.05)。見表2。

表2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白與卵巢癌臨床參數的關系

2.3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表達的關系 p-AKT和PI3K在上皮性卵巢癌中的表達呈正相關(r=0.552，P<0.01)，p-AKT和PTEN上皮性卵巢癌中的表達呈負相關(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN上皮性卵巢癌中的表達呈負相關(r=-0.535，P<0.01)。見表3。

表3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表達的關系 例

3 討論

PI3K的擴增、AKT的過度活化，或PI3K/AKT的某些調控成分如PTEN的功能缺失，可使PI3K/AKT通路的調節失調，進而導致多種腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移及化療耐藥。PI3K屬于原癌基因，它是連接細胞外信號和細胞內應答的重要分子，在一系列信號分子的影響下，對細胞凋亡起重要作用。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號轉導蛋白。AKT表達水平增高后可以保護細胞免受凋亡，進而促進細胞生長[2]。AKT是PI3K下游的靶蛋白，PI3K活化的產物是AKT活化所必需的。PI3K活化的產物為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，它們可以使AKT的構象發生改變，導致AKT由細胞質轉至細胞膜，通過一系列的級聯反應使AKT發生活化，從而導致腫瘤的發生、發展[3]。有研究表明PI3K和AKT的過度表達在卵巢癌中普遍存在，導致細胞延遲死亡[4]，進而促進卵巢癌的發生。因此，p-AKT可能是卵巢癌發生、發展過程中的重要因素，并與卵巢癌的轉歸及預后密切相關。PTEN是腫瘤抑制基因，人體幾乎所有組織都含這種蛋白質。它通過阻止細胞生長、分裂的速度過快或者分裂不受控制的方式，調控細胞分裂周期。PTEN蛋白可以通過去除磷酸基進而修飾其他蛋白質和脂肪。有報道PTEN突變后細胞內PIP3含量增高，使細胞重新表達PTEN后細胞內PIP3開始下降，說明PTEN是以PIP3為底物的磷酸酶，它使PIP3的3’位脫磷酸，從而形成PIP2，喪失PIP3的信使功能，成為拮抗PI3K、下調AKT通路的重要調節基因。因此，PTEN常被稱為PI3K/AKT信號通路的“開關”。國外亦可見PTEN通過抑制PI3K/AKT通路抑制腫瘤發生發展的報道，包括卵巢癌[5]，黑色素瘤，胃癌，膠質瘤等[6，7]。

本研究發現，p-AKT及PI3K在卵巢組織中呈現高表達，而在正常卵巢組織中表達很弱。正常組及良性組的表達顯著低于卵巢癌組(P<0.05)，提示p-AKT和PI3K可能對于卵巢癌的發生、發展及預后起重要作用。隨著卵巢癌的臨床期別上升，腫瘤細胞的分化程度下降，p-AKT和PI3K的陽性表達率越高。有研究發現從正常卵巢上皮細胞到不典型增生再到卵巢癌的轉化過程中，p-AKT和PI3K的表達水平不斷增高，并可伴隨腫瘤抑制基因的失調節，從而喪失腫瘤抑制基因抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，是p-AKT和PI3K提高卵巢腫瘤細胞生存能力的證據[8]。

本實驗表明正常卵巢組織中PTEN的陽性表達率明顯高于卵巢上皮性癌組織，隨著PTEN的陽性表達率顯著下降，其抑制腫瘤細胞生長及促進腫瘤細胞凋亡和能力逐漸減弱，無法使PTEN編碼的產物PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，從而喪失了對P13K/Akt信號通路的負性調節。因此，PTEN的表達缺失促進了卵巢癌的發生。正常組、良性組中PTEN的陽性表達與卵巢癌組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。而良性組與正常組比較差異無統計學意義(P<0.05)，反映了PTEN對腫瘤細胞增殖的抑制程度。

PTEN的表達水平與AKT的磷酸化水平呈負相關，且患者的生存期與PTEN的表達水平呈正相關、與AKT的磷酸化水平呈負相關。PTEN的表達水平隨著卵巢癌病理分級及臨床分期的升高而下降，卵巢癌細胞分化程度與PTEN的陽性表達率呈正相關。有實驗證實PTEN可以抑制卵巢癌細胞的生長、促進卵巢癌細胞的凋亡、提高卵巢癌細胞對抗癌基因的敏感性[9]，并與化療耐藥有關[10]。因此，PTEN蛋白可能是評價卵巢癌惡性生物學行為的重要參考指標，并可能會成為卵巢癌早期診斷和評價預后的重要分子標志物。因此以PI3K/AKT通路為靶點的小分子藥物將有望對卵巢癌的治療起到非常重要的作用，并為解決化療耐藥問題提供新思路。

1 郭瑞霞，魏麗惠.磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號傳導通路與婦科惡性腫瘤的研究進展.中華婦產科雜志，2005，40：358-360.

2 Brodbeck D,Cron P,Hemmings B,et al.A human protein kinase Bgamm with regulatory phosphorylation sites in the activation loop and in the C-terminal lydrophobic domain.J Biol Chem,1999,274:9133-9136.

3 Saga Y,Mizukami H,Suzuki M,et al.Overexpression of PTEN increases sensitivity to SN-38,an active metabolite of the topoisomerase I inhibitor irinotecan,in ovarian cancer cells.Clin cancer Res,2002,8:1248-1252.

4 Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt singnalling pathway in human malignancy.Cell Signal,2002,14:381-395.

5 Sansal I,Sellers W.The Biology and Clinical Relevance of the PTEN Tumor Suppressor pathway.J Clin Oncol,2004,22:2954-2963.

6 Maehama T,Dixon JE.The tumor suppressor,PTEN/MMAC1,dephosphorylates the lipid second messenger,phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate.J Biol Chem,1998,273: 13375-13378.

7 Waite KA,Eng C.Protean PTEN: form and function.Am J Hum Genet,2002,70:829-844.

8 Wang HQ,Altomare DA,Skele KL,et al.Positive feedback regulation between AKT activation and fatty acid synthase expression in ovarian carcinoma cells.Oncogene,2005,24:3574-3582.

9 Wu R,Hendrix-Lucas N,Kuick R,et al.Mouse Model of Human Ovarian Endometrioid Adenocarcinoma Based on Somatic Defects in the Wnt/beta-Catenin and PI3K/Pten Signaling Pathways.Cancer Cell，2007,11:321-333.

10 Pandey SK,He HJ,Chesley A,et al.Wortmannin-sensitive pathway is required for insulin-stimulated phosphorylation of inhibitor kappa Balpha.Endocrinology,2002,143:375-385.

ExpressionandsignificanceofphosphorylatedproteinkinaseB,PI3KandPTENproteininovarianepithelialcancer

CHENGJia*,YANGXiaolong,XUNZhijie*,etal.*TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056002,China

ObjectiveTo analyze the expression and significance of phosphorylated protein kinase B (p-AKT),PI3K and PTEN protein in ovarian epithelial cancers and to investigate the correlation among them and the correlation between their expression and prognosis of patients with ovarian epithelial cancer.MethodsThe positive expression rates of p-AKT,PI3K and PTEN were detected by immunohistochemical method in 10 cases of normal ovarian tissues,20 cases of ovary benign epithelial tumors and 60 cases of ovarian epithelial cancers.ResultsThe positive expression rates of p-AKT and PI3K in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors were significantly lower than those in ovarian epithelial cancers,however,the positive expression rates of PTEN in ovarian epithelial tissues were significantly lower than those in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors (P<0.01).The expression levels of p-AKT,PI3K and PTEN were closely correlated to clinical stage,differentiation degree of cancer cells,pathological classification and lymph node metastasis (P<0.01),however,which were not related to patient's age,histological type and ascites (P>0.05).The expression of p-AKT was positively related to that of PI3K in ovarian epithelial cancer (r=0.552,P<0.01),however,the expression of p-AKT was negatively related to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.497,P<0.01),and the expression of PI3K was negatively correlated to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.535,P<0.01).ConclusionThe overexpression of p-AKT and PI3K followed by absence of PTEN are involved in the pathogenesis and development of ovarian epithelial cancer.

ovarian cancer; AKT; PTEN; PI3K;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.006

056002 河北省邯鄲市第一醫院(程佳、尋志杰、張彩英、司華鵬、彭志美、于華、霍艷)；河北省邯鄲市中心醫院(楊曉龍)

R 737.31

A

1002-7386(2014)04-0501-04

2013-08-11)