原花青素對腦缺血再灌注損傷羥自由基含量和腫瘤壞死因子-α表達影響

翟婷婷 蔡紅艷 云愛華

原花青素對腦缺血再灌注損傷羥自由基含量和腫瘤壞死因子-α表達影響

翟婷婷 蔡紅艷 云愛華

目的 觀察葡萄籽原花青素(GSP)對大鼠腦缺血再灌注損傷中羥自由基含量和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響。方法 Wistar大鼠48只隨機分為四組：假手術組、缺血再灌注模型組、GSP大劑量(40 mg/kg)組、GSP小劑量(10 mg/kg)組, 每組12只, 應用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型(MCAO), 缺血2 h再灌注24 h。假手術組手術過程相同但不栓塞大腦中動脈。其中GSP大劑量組、小劑量組術前7 d分別腹腔注射2 ml/kg 葡萄籽原花青素, 模型組大鼠術前7 d腹腔注射2 ml/kg生理鹽水, 1次/d, 再灌注前15 min加注1次。MCAO模型制作完成后首先進行神經功能評分, 然后利用生物化學技術檢測大鼠血清羥自由基含量和一氧化氮合酶活性, 免疫組織化學染色檢測半暗帶區顳頂部腦皮質神經細胞TNF-α的表達。結果 GSP對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用。其機制可能與降低NOS活性、腦組織羥自由基含量, 降低腦組織TNF-α的表達, 抑制神經細胞凋亡等有關。結論 GSP對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用, 具有臨床研究價值。

腦缺血再灌注；原花青素；羥自由基；腫瘤壞死因子-α

腦血管疾病是指腦血管病變所引起的腦功能障礙。腦缺血是一種以腦微循環血流量和葡萄糖/能量代謝障礙為特征的腦血管疾病。腦缺血再灌注損傷［1］是一個復雜的病理生理過程, 近來研究發現, 腦血流中斷和再灌注使腦的細胞產生損傷是一個快速的級聯反應, 這個級聯反應包括許多環節,這些環節互為因果, 彼此重疊, 并相互聯系, 形成惡性循環,最終導致細胞凋亡和壞死。

葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin, GSP)系從葡萄籽中提取分離［2］制得的一種新型高效抗氧化劑, 其原花青素含量高達95%, 得到深入廣泛的關注。近代研究發現, 葡萄籽原花青素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、減輕缺血再灌注損傷、抗突變、抗病毒、減慢早老性癡呆和帕金森氏病發展進程以及調節血管細胞功能和降低血小板凝聚［1］等保護作用。本研究旨在應用組織病理學、免疫組織化學等方法探討GSP在體內對大鼠腦缺血再灌注損傷中羥自由基含量和TNF-α表達的影響。從而為臨床腦保護劑的研制和開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康Wistar大鼠48只, 體重280～330 g, 雄性, 由山東省魯抗動物中心提供。

1.2 方法 采用改良Koizumi法制作MCAO模型。Wistar大鼠48只隨機分為四組, 每組12只。其中GSP大劑量組、小劑量組術前7 d分別腹腔注射2 ml/kg 葡萄籽原花青素, 模型組大鼠術前7 d腹腔注射2 ml/kg生理鹽水, 1次/d, 再灌注前15 min加注1次。

1.3 統計學方法 用SPSS18.0統計學軟件處理數據, 計量資料以均數±標準差( x-±s)形式表示, 實施t檢驗；計數資料以率(%)形式表示, 實施χ2檢驗, P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

①GSP大、小劑量組都能改善大鼠神經功能障礙癥狀, GSP大劑量組(4.65±0.53)較小劑量組神經功能評分(5.35±0.38)降低, 差異有統計學意義(P＜0.05)。②與假手術組(231.70±44.94) U/ml比較, 模型組大鼠血清抑制羥自由基能力(865.13±45.20) U/ml明顯降低, 差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較, GSP用藥組大鼠血清抑制羥自由基能力明顯升高, 差異有統計學意義(P＜0.05), 且大劑量組(421.15±35.40) U/ml較小劑量組(666.51±41.07) U/ml血清抑制羥自由基能力升高作用明顯。③光學顯微鏡下觀察假手術組TNF-α(13.19±3.42)%極少表達, 模型組可見大量陽性細胞表達, TNF-α表達陽性率(54.63±7.26)%顯著高于假手術組, 差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較, GSP用藥組TNF-α表達受到抑制, TNF-α表達陽性率顯著低于模型組,且大劑量組(26.67±5.35)%較小劑量組(36.54±7.25)%陽性細胞數降低明顯, 差異均有統計學意義(P＜0.05)。陰性對照片(不加一抗)未檢測到陽性細胞, 說明結果可信。

3 討論

腦血管疾病是指腦血管病變引起的腦功能障礙, 腦血管疾病的發病率、死亡率及致殘率均高, 它與心臟病、惡性腫瘤構成人類的三大致死病因。腦缺血損傷的機制十分復雜,缺乏有效的干預手段, 它的復雜性主要表現在腦缺血類型的復雜性和腦缺血損傷分子機制在時空變化上的復雜性以及各作用因子間相互影響的復雜性。近年來隨著溶栓療法、動脈搭橋術、導管技術以及器官移植等方法的建立和推廣, 使缺血器官組織更快地重新獲得血液供應, 可明顯減輕細胞損傷,提高臨床療效, 但是在動物實驗和臨床觀察中也發現恢復血液再灌注后部分動物或患者細胞功能代謝障礙及結構破壞反而加重, 因而將這種血液再灌注使缺血性損傷進一步加重的現象成為缺血-再灌注損傷。缺血再灌注損傷的機制主要涉及興奮性氨基酸的毒性效應、細胞凋亡、鈣離子超載、能量代謝障礙、自由基損傷作用、炎癥反應等多方面。

腦缺血再灌注時會產生大量自由基, 廣泛攻擊富含不飽和脂肪酸雙鍵的神經元膜和微血管, 引起脂質過氧化“瀑布狀”連鎖反應和微循環障礙, 損傷細胞膜和DNA, 致使大量神經元損害。抗氧化劑和有效阻斷或防止自由基的損傷, 是目前治療和預防腦缺血疾病研究的重點。

本實驗研究結果表明葡萄籽原花青素對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用, 其可能的機制為：通過其抗氧化活性提高清除氧自由基能力, 減少脂質過氧化反應, 減輕氧自由基對腦組織的損傷；抑制NOS活性減輕NO產生的毒性作用；降低TNF-α的表達抑制神經細胞凋亡。腦缺血再灌注引起的損傷是一個復雜的時間和空間級聯反應過程, 涉及多個作用機制, 葡萄籽原花青素作為一種天然高效抗氧化劑不僅毒副作用低, 而且可通過清除自由基, 減輕NO的毒性作用及抑制TNF-α的表達等多方面保護腦組織缺血再灌注損傷。

GSP對大鼠腦缺血再灌注神經功能障礙有明顯改善作用。能降低大鼠腦缺血再灌注損傷側腦組織羥自由基含量。提高清除自由基能力及抗脂質過氧化作用, 能夠降低NOS活性, 減少NO的生成, 減輕NO的毒性作用。可抑制大鼠腦缺血再灌注損傷側半暗帶顳頂部皮質TNF-α的表達。表明GSP對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用, 其機制可能與降低NOS活性、腦組織羥自由基含量；降低腦組織TNF-α的表達, 抑制神經細胞凋亡等有關。

［1］ Li L, Shen YM , Yang XS, et al.Effects of spiramine T on antioxidant enzymatic activities and nitric oxide production in cerebral ischemia-reperfusion gerbils .Brain Res , 2002, 944(1):205-209.

［2］ 呂麗爽, 曹棟.脫脂葡萄籽中低聚原花青素的提取.無錫輕工大學學報, 2001, 20(2): 208-210.

2014-04-11］

262500 山東省青州榮軍醫院