水稻S5-ORF3蛋白質的進化分析

張達瀚，張 屹

(1. 華中農業大學生命科學技術學院，湖北武漢 430070；2.河北科技大學理學院，河北石家莊 050018)

水稻S5-ORF3蛋白質的進化分析

張達瀚1，張 屹2

(1. 華中農業大學生命科學技術學院，湖北武漢 430070；2.河北科技大學理學院，河北石家莊 050018)

生殖隔離在形成新物種和物種同一性的保持中有重要作用，因而在水稻優化育種中有重要的意義。S5位點是一個已克隆的控制水稻生殖隔離的基因，它產生的S5-ORF3，ORF4和ORF5蛋白質共同調控著indica-japonica雜交后代的育性，特別是S5-ORF3蛋白質在打破水稻亞種indica-japonica之間的生殖隔離與促進物種間的基因交流中發揮重要作用。針對S5-ORF3的進化分析對于研究它的功能和起源很重要，但目前尚無報道。本文基于序列和進化分析，提出S5-ORF3為一種定位在內質網中的新的HSP70家族蛋白，但缺乏HSP70的C端的多肽結合結構域，推測S5-ORF3可能通過影響alpha-淀粉酶的合成來作用于內質網壓力；找到了ORF3的19條同源蛋白，并用極大似然算法構建了可靠的進化樹，發現水稻的S5-ORF3與節節麥的luminal-binding蛋白進化關系最為密切；作了置信度100%的S5-ORF3蛋白質的三維結構預測，預測了居中的配體綁定位點；發現了水稻的S5-ORF3與其他HSP70蛋白相比獨特的基序，為進一步研究S5-ORF3的作用機理和演化歷史提供了線索和數據支持。

水稻；S5-ORF3 蛋白；進化樹；正向選擇；配體結合

生殖隔離限制了物種間的基因交流，一般來說，水稻的2個亞種indica和japonica間產生的后代是不育的[1-2]。研究發現，在水稻基因組的S5位點有一個與生殖隔離相關的“破壞與保護蛋白系統”，該系統由3個緊密連鎖的基因ORF3，ORF4，ORF5組成，這三者共同調控著indica-japonica雜交后代的育性，ORF4+與ORF5+導致了內質網的壓力，這種壓力導致雜交水稻雌配子敗育，而ORF3+作為保護者又會阻止內質網壓力的產生，從而抑制雌配子敗育并打破生殖隔離，使indica和japonica之間的基因可以交流[3]。研究發現S5-ORF3與HSP70有一定的同源性。本研究希望知道哪些蛋白與ORF3同源，它們的進化關系如何；水稻的S5-ORF3有哪些正向選擇位點一直伴隨和影響著這組蛋白質從古至今的功能變化；水稻的S5-ORF3蛋白質的結構和與配體的結合位點是怎樣的等等，這些對于進一步理解這個關鍵的蛋白質有重要的意義。本研究重點進行S5-ORF3的進化分析，為進一步理解水稻生殖隔離和基因交流提供線索和數據支持。

植物的HSP70是由多個基因家族編碼的。HSP70家族按表達情況可分為HSC70 (heat shock cognate protein 70)和 HSP70兩大類。HSC70在所有細胞內都能表達，同時也受一定程度的熱誘導，是結構型HSP；HSP70在正常情況下表達很少或不表達，而在熱刺激或其他脅迫下表達迅速增強，屬于誘導型的HSP。根據它在植物中的亞細胞定位的位置，HSP70可分為4個亞族[4]：1)C端含有EEVD基序的HSP70，定位于細胞質中；2)含HDEL基序的HSP70，定位在內質網中，也稱BiP蛋白；3)含PEAEYEEAKK的HSP70，定位于線粒體中；4)含PECDVLDADFTDSK的HSP70，定位于質體中。總體來說，HSP70易于存在于細胞器中。但是水稻的S5-ORF3蛋白質中沒有這幾種基序(motif)，只含有一個與內質網中的HSP70相似的基序HDLL。從嚴格意義上說，水稻的S5-ORF3是一種新的HSP70。

與S5-ORF3最相近的這種定位在內質網中的HSP70，即BiP蛋白，全名叫 the luminal binding protein, 是一種分子伴侶。在內質網壓力情況下，BiP的過表達有助于alpha-淀粉酶[5]的合成。但目前S5-ORF3的熱激誘導實驗還沒有做過，不能斷定它是否為一種HSC70，也不能斷定S5-ORF3緩解內質網壓力的機制是否也與alpha-淀粉酶的合成有關。

1 材料與方法

1.1數據

水稻的 S5-ORF3 蛋白質有4 條：JX138498—JX138501，可從NCBI上下載得到。選擇indicagroup cultivar Nanjing 11 為 Query Sequence，通過blastp (protein-protein blast) 方法，從NCBI上執行同源搜索而得到100條蛋白質序列(數據庫更新至2014-01-25)。由于hypothetical protein與predicted protein，partial protein以及putative protein不能保證蛋白質的準確性和完整性，所以舍去在說明行中含有partial，hypothetical, predicted，candidate division，uncluture，putative單詞的序列，同時也舍去沒有明確說明所屬物種的序列。然后，在余下的序列中為每個物種保留一條ident值最高的序列。最終，得到S5-ORF3的19條同源序列。加上水稻的S5-ORF3蛋白質4條，此次蛋白質進化分析所用的蛋白質序列共23條，它們所對應的物種名字及Gene Bank ID如下所示：

japonicagroup cultivar balilla 水稻培育品種balilla: gi|406066535

indicagroup cultivar Nanjing 11 水稻培育品種南京11號: gi|406066539

cultivar02428 水稻培育品種02428: gi|406066554

cultivardular 水稻培育品種dular: gi|406066557

aegilopstauschii節節麥: gi|475588157

populustrichocarpa毛果楊: gi|566196410

glycinemax大豆: gi|2642238

ricinuscommunis蓖麻: gi|255555659

solanumlycopersicum番茄: gi|350539203

hordeumvulgaresubsp.vulgare大麥: gi|476003

triticumurartu烏拉爾圖小麥: gi|474200923

theobromacacao可可: gi|508777841

cyanophoraparadoxa藍載藻: gi|255977229

capsicumsp. JYM-2013 辣椒: gi|528746217

nicotianatabacum煙草: gi|729623

gossypiumhirsutum陸地棉: gi|211906506

cucumissativus黃瓜: gi|6911549

arabidopsisthaliana擬南芥: gi|15241844

vitisvinifera葡萄: gi|297742397

zeamays玉米: gi|162457723

maluspumila蘋果: gi|57639078

pseudotsugamenziesii花旗松: gi|7635897

spinaciaoleracea菠菜: gi|3913786

1.2方法

S5-ORF3的同源蛋白搜索用blastp (protein-protein blast)方法，進化樹的繪制用 Mega5[6]的Max-likelihood方法，保守motif的發現用MEME[7]，正向選擇位點用Mrbayes 3.1.2[8]計算，蛋白質結構與配體搜索用網上軟件Phyre2[9]和3DligandSite[10]執行。圖1示出了水稻4條S5-ORF3蛋白質與其19條同源蛋白序列的聯配情況。

圖1 4條S5-ORF3蛋白質與其19條同源蛋白序列的聯配Fig.1 Alignment of 4 S5-ORF3 proteins and its 19 homologous sequences

A—HSP 70的結構示意圖，KD為蛋白質質量單位，千道爾頓；B—23條序列的聯配圖，其中，水稻的4條ORF3序列(JX138498—JX138501)在最上方，其下面緊挨著的是節節麥的同源序列，它們與其他序列(包括HSP 70)相比，明顯缺乏后面的C-端區域；C—S5-ORF3蛋白質及其同源序列中置信度最高的3個基序(motif)，其中第3個motif“TTYS…”motif在水稻的S5-ORF3與藍載藻Bip蛋白中沒有，另外2種motif則是所有序列所共有的

2 結果與討論

用Nanjing 11 S5-3(indicagroup cultivar Nanjing 11 gene的產物)在NCBI中用blastp進行搜索，找到19條有代表性的同源序列，發現ORF3的產物蛋白質主要與Luminal-binding protein和HSP70在進化上相關。

2.1與HSP70蛋白質的相關性分析

植物的HSP 70也與植物的脅迫應答機制、分子伴侶的作用及抗逆性的提高有密切關聯[11]，整體來說(見圖1 A)，包括N端保守域和C端區域2個部分。ORF3在blastp搜索中，局部結構域展現了與HSP 70的高度相關性，如圖1 B 所示，ORF3與HSP 70蛋白的N端出現了大段的連配區域，說明ORF3有ATPase相似的結構域，但缺乏HSP 70后面的C端區域。圖1 B 最上面的4條序列是水稻的S5-ORF3序列：JX138498—JX138501，發現在聯配圖中，“AIAIPRAAPA”為S5-ORF3所特有，而它的同源蛋白質沒有氨基酸區域；其他序列所擁有的從“VIPAKKSQTFTTYQDQQTTVTI…”開始的蛋白質區域也是S5-ORF3蛋白質所沒有的。筆者推測，這2個片段在決定S5-ORF3與luminal-binding蛋白和HSP 70蛋白在結構和功能差異上發揮重要作用。

2.2與luminal-binding蛋白質的相關性分析

這23條序列的blast聯配結果(見圖1 B)顯示，水稻的S5-ORF3與gi|475590630|gb|EMT21528.1| luminal-binding protein 2 [aegilopstauschii] (節節麥)、gi|255977229|dbj|BAH97106.1| luminal binding protein BipCyanophoraparadoxa(早期散發藻類藍載藻)最為相似，也就是說它與luminal-binding蛋白質的相似程度最大。luminal-binding 蛋白緩解內質網壓力，增強煙草和大豆對于旱災的抗逆性[5，12-13]，而S5-ORF3所產生的蛋白質也有緩解內質網壓力的功能[3]，所以，推斷它與luminal-binding 的共同結構域對于緩解內質網壓力是至關重要的。

2.3在水稻S5-ORF3蛋白質及其同源序列中尋找保守基序和正向選擇位點

為了在S5-ORF3蛋白質及其同源序列中尋找保守的基序(motif)，筆者應用了MEME suite[7]，并且把發現的前3個得分最高的motif展示在圖1 C中。這些motif的生物學功能有待進一步研究。在圖1 C中從上到下，第1個motif的正則表達式為RALSSQHQVRVEIESLFDG[VT]DFSEPLTRARFEELNNDLFRKTMGPVKKAM，E值為7.8×10-734，在所有序列中都存在；第2個motif的正則表達式為KNILVFDLGGGTFDVSILTIDNGVFEVL[AS]TNGDTHLGGEDFD[QH]R[IV]M[ED]YFI，E值為4.0×10-724，是在所有序列中都有的；第3個motif的正則表達式為TTYSCVGVYKNGHVEIIANDQGNRITPSWVAFTD[SG]ERLIGEAAKNQAAVN，E值為3.0×10-720，在水稻的S5-ORF3與藍載藻中沒有第3個motif。

在S5-ORF3及其同源體的進化歷史中，每個氨基酸或密碼子都是一個位點。有許多位點是保守的，因為它們擔負著重要的結構和功能，若變化就會導致個體死亡；有的則只進行著中性的漂變，密碼子只作同義變化；還有一些位置則擔負起功能進化的角色，隨著歲月的流逝、物種的進化，它們通過適當的同義和異義的突變使蛋白質和個體更能適應環境與條件，這些密碼子為“正向選擇位點”。但是，通過MrBayes3.1.2[8]軟件的計算，并沒有發現S5-ORF3的正向選擇位點，因為位點的最大正向選擇概率僅為0.132 5，這是不顯著的。缺乏正向選擇位點應該與HSP70家族蛋白質的保守性有關。

2.4水稻的4條S5-ORF3蛋白質與其19條同源序列所做的進化樹

用Mega5中的ML算法構建進化樹并且用bootstrap 500次以檢查分枝的置信度。如圖2所示，S5-ORF3在包括藻類在內的很多植物中都有同源體，水稻的S5-ORF3蛋白質序列與節節麥和藍載藻的luminal-binding 蛋白有非常緊密的親緣關系。該進化樹的根部分支的bootstrap置信度很高，從而是可靠的。從進化樹上看，與ORF3同源的蛋白質序列整體上可分為2組，一組是由節節麥的luminal-binding 蛋白與水稻的S5-ORF3組成的，而HSP70與其他物種的luminal-binding蛋白組成另外一組。從連配圖(見圖1 B)中可見，這2組序列的最大差異在于它們的C端結構域的有無。

圖2 S5-ORF3與19條同源序列的進化樹及Nanjing 11 S5-ORF3蛋白質的結構和配體位置圖 Fig.2 Evolutionary tree of S5-ORF3 as well as 19 homologous sequences, and the protein structure and the ligand site of Nanjing 11 S5-ORF3

很明顯，水稻的4條S5-ORF3蛋白質序列與節節麥和藍載藻的luminal-binding 蛋白有非常緊密的親緣關系。其中，結構圖由網絡服務器Phyre2 預測產生。PDB庫中的模板為c3d2fc，這個結構預測可信度100%。N端為紅色，C端為紫色。3DligandSite作了配體綁定位點預測，Nanjing 11 S5-ORF3的蛋白質中部有18個可能的配體結合位點。

2.5水稻S5-ORF3蛋白質的結構及可能配體結合位點的預測

用網絡服務器Phyre2[9]來預測S5-ORF3 Nanjing 11的蛋白質結構。因為Nanjing 11是典型的ORF3+序列，這個序列對于ORF4和ORF5有顯著的上位效應。該蛋白質的結構(如圖2的左上方“蛋白質結構圖”所示)由15個alpha螺旋、18個beta片和一些coil組成。整體來說，該蛋白質結構來源于sse1p和HSP 70的組合，對于PDB庫中的模板c3d2fc的覆蓋度為83%，模型預測可信度100%，這應該是得益于HSP70家族的蛋白質保守性很強。此外，發現在S5-ORF3的中部有一個空洞，有可能是配體的結合位置。另外，預測了S5-ORF4的三維結構，是2個巨大的alpha螺旋被一條細小的coil所連接。為了進一步研究S5-ORF3的配體結合的性質，把用網絡服務器Phyre2預測得到的S5-ORF3結構的PDB原子坐標文件輸入配體結合位點預測軟件，3D ligandSite[10]來預測ORF3可能的配體結合位點。這個軟件是依據結構的相似性來預測結合位點的，適用于這種保守性很強的蛋白質的配體結合點的預測工作。預測結果如圖2右下方的“配體位置圖”所示，該配體位于S5-ORF3蛋白質的中部。預測得到的可能的18個配體綁定位點為68HIS, 70GLY,71ASN, 72THR, 73ASN, 260HIS, 262GLY, 263GLY, 264ARG, 291GLY, 292ASP, 329GLU, 332LYS, 333LYS, 336SER, 400GLY, 401SER, 403ARG。

3 結 語

S5-ORF3的熱激表達效應、緩解內質網壓力的機制是否也與alpha-淀粉酶的合成有關，它中部的配體是什么，S5位點中其他的調控雜交不育的因素，如非編碼RNA 及其可能所引發的的上位效應等[14-16]，仍需要做進一步的實驗研究。

致 謝：感謝華中農業大學張啟發院士和歐陽亦聃副研究員的熱情幫助。

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Evolution analysis of rice protein S5-ORF3

ZHANG Dahan1, ZHANG Yi2

(1. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan Hubei 430070, China; 2.School of Science, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

Reproductive isolation is important in speciation and maintaining species identity, so it is very significant in optimization of breeding rice. S5 locus is a cloned gene controlling the reproductive isolation, which produces proteins S5-ORF3, ORF4 and ORF5 that work together to regulate fertility in indica-japonica hybrids, and especially the S5-ORF3 protein plays a very important role in distorting reproductive isolation among indica-japonica and enhancing gene flow among populations. The evolutionary analysis of S5-ORF3 is significant for studying its function and origin, which is still no reported. In this paper, based on sequence and evolution analysis, it is proposed that the S5-ORF3 is a new HSP70 family protein which is located in endoplasmic reticulum (ER) and lacks of multi-peptide binding domain. Evolution analysis suggests that S5-ORF3 might act on ER stress via affecting alpha-amylase synthesis; moreover, 19 homologous proteins of S5-ORF3 are found, ML phylogenetic tree is constructed, and it is found that there is close evolution relationship between rice S5-ORF3 and a luminal-binding protein of Aegilops tauschii; the 3D structure of S5-ORF3 with confidence of 100% is predicted, as well as a ligand-binding site located in the middle of S5-ORF3. The specific motif of rice S5-ORF3 among HSP70 family is also found. This work may provide some clues and data for studying function and evolution history of rice S5-ORF3.

rice; protein S5-ORF3; phylogenetic tree; positive selection; ligand-binding

2014-04-04；

2014-05-06；責任編輯：張士瑩

國家自然科學基金(J1103510,11171088);教育部重點項目(212011)；中央高校基本科研業務費專項資金(2014BC020)；河北省自然科學基金(A2011208002)

張達瀚(1996-)，男，河北石家莊人，主要從事植物生物學方面的研究。

張 屹教授，博士。E-mail:zhaqi1972@163.com

1008-1542(2014)04-0397-06

10.7535/hbkd.2014yx04015

Q816

A

張達瀚，張 屹.水稻S5-ORF3蛋白質的進化分析[J].河北科技大學學報,2014,35(4):397-403.

ZHANG Dahan, ZHANG Yi.Evolution analysis of rice protein S5-ORF3[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(4):397-403.