水通道蛋白-8對結腸癌細胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影響

李建強 張宏蕊 石曉明 呂柏楠

·論著·

水通道蛋白-8對結腸癌細胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影響

李建強 張宏蕊 石曉明 呂柏楠

目的通過表達水通道蛋白-8(AQP-8)真核表達載體，觀察水通道蛋白AQP-8對HT-29細胞凋亡及凋亡抑制蛋白(IAPs)表達的影響。方法取對數生長期的人結腸癌HT-29細胞株用于實驗。構建AQP-8真核表達載體并轉染HT-29細胞，通過Western blot檢測GFP-AQP-8轉染效率；采用MTT法檢測各組細胞增殖抑制率；流式細胞術檢測細胞凋亡率；通過Real Time-PCR和Western blot檢測轉染GFP-AQP-8的HT-29細胞凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成員c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin和Livin表達水平。結果Western blot結果顯示，GFP-AQP-8轉染后結腸癌HT-29細胞AQP-8基因表達顯著上調(P<0.05)。MTT分析結果顯示，轉染了GFP-AQP-8的結腸癌HT-29細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；流式細胞分析發現，轉染了GFP-AQP-8的HT-29細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。Real Time-PCR和Western blot結果顯示，與轉染GFP-N1的陰性對照組相比較，轉染了GFP-AQP-8的HT-29細胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表達水平下降(P<0.05)，NIAP表達變化不明顯(P<0.05)。結論過表達AQP-8可抑制HT-29細胞生長，并能通過下調c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表達誘導HT-29細胞凋亡。

水通道蛋白-8；結腸腫瘤；凋亡；凋亡抑制蛋白

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，世界范圍內惡性腫瘤死因中，其病死率居第二位[1]。結腸癌易發生浸潤和轉移的特點往往導致治療效果不佳。而在腫瘤浸潤和轉移過程中的代謝與營養交換離不開水分子的參與。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一類廣泛存在于細胞膜上的、具有高選擇性的、特異轉運水分子的通道[2]。研究顯示，水通道蛋白在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用[3]，其中包括對腫瘤細胞凋亡的影響[4]。細胞凋亡抑制蛋白(inhibitaors of apoptosis proteins,IAPs)是一類重要的凋亡抑制因子，參與了多種細胞的凋亡調控。本文通過體外過表達AQP-8，觀察其對結腸癌細胞凋亡及IAPs家族成員表達的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 結腸中分化腺癌細胞株HT-29，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MTT，美國Sigma公司；DMEM/F12培養液、胰蛋白酶，Gibco公司；熒光定量RT-PCR試劑盒，美國Promega公司；ABI 7500 PCR儀，美國ABI公司；AQP-5、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH抗體，美國Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；FASCalibur流式細胞儀，BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：人HT-29細胞于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM/F12培養基中培養，于37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養箱中孵育。用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 GFP-AQP-8轉染和實驗分組：用軟件設計AQP-8基因特異性引物，提取HT-29細胞總RNA，采用RT-PCR法擴增AQP-8基因，與質粒載體GFP-N1進行酶切、鏈接，經過轉化、篩選、鑒定并測序。轉染前24 h于6孔板中接種HT-29細胞，密度為4×106個/ml。轉染前用無血清無抗生素的DMEM/F12清洗細胞，經脂質體介導法，按照試劑說明書用轉染試劑LipofectamineTM 2000將GFP-AQP-8或對照質粒GFP-N1轉染HT-29細胞。轉染24 h后，檢測轉染效率及PCNA和P53表達。實驗分組為：正常對照組、GFP-N1空載體組和GFP-AQP-8組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖率：對數生長期的HT-29細胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化并接種于96孔板，接種密度為5×104個/ml，每組設6個復孔。各組細胞于實驗結束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫振蕩15 min至結晶完全溶解，用酶標儀于波長490 nm測吸光度OD值。以上實驗重復3次。增殖抑制率(%)=(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，4℃，500 g離心，去上清，沉淀中加入1 ml預冷的70%乙醇，輕輕吹打，4℃固定過夜。4℃，500 g，離心10 min，去上清，用1×PBS清洗2次。加入1 ml PI染液將細胞重懸，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測。以上實驗重復3次。

1.2.5 RNA提取及Real Time-PCR：收集細胞，按照Invitrogen公司Trizol試劑的產品說明書要求，采用一步法提取RNA。測定RNA純度和濃度，并經1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性后，各組都取1 μg RNA，按試劑盒說明書要求進行反轉錄反應及熒光實時定量PCR反應。PCR反應參數為：95℃ 5 min預變性后，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行40個循環，于每個循環的延伸階段采集熒光信號。擴增結束后，以GAPDH為內參照基因，計算目的基因表達的相對定量值(RQ值)及以此為依據進行統計學分析。所用引物序列為如下：c-IAP1上游引物：5’-GAAGACATCTCTTCATCGAGG-3’，下游引物：5’-CCACAGGTGTATTCATCATGAC-3’c-IAP2上游引物：5’-TCCTAGCTGCAGATTCGTTC -3’，下游引物：5’-GGTAACTGGCTTGAACTTGAC-3’。XIAP上游引物：5’-GCACGAGCAGGGTTTCTTTATACTGGTG-3’，下游引物：5’-CTTCTTCACAATACATGGCAGGGTTCCTC-3’。NIAP上游引物：5’-CTGGGCCTAGATGCAGTTCAG -3’，下游引物：5’-ACGGCTCATAAGTCACAAAAGTC-3’。Survivin上游引物：5’-CTTTCTCAAGGACCACCGCA-3’，下游引物5’-GCCTCGGCCATCCGCT-3’。Livin上游引物：5’-AGTTCCTGCTCCGGTCAAAA-3’，下游引物5’-GCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3’。GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。

1.2.6 Western blot法檢測目的蛋白質表達：收集細胞，用預冷的1×PBS洗滌3次，于細胞裂解液中重懸細胞，冰上裂解間斷渦旋30 min后，4℃，8 000 r/min離心10 min，上清即為細胞總蛋白。用改良的Lowry法定量后，各組取等量的蛋白依次經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、電轉移至PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，分別用稀釋后的AQP-8、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH一抗4℃孵育過夜，TTBS于室溫搖床振搖漂洗三次后加入相應二抗，室溫孵育2 h，化學發光法進行顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。用各蛋白吸光度值/內參照吸光度值的比值進行比較。

2 結果

2.1 AQP-8真核表達載體轉染效率的鑒定 Western-blot結果顯示，轉染了GFP-N1空載體組的對照細胞中AQP-8表達非常低，而轉染了GFP-AQP-8的HT-29細胞AQP-8的表達顯著上調，表明GFP-AQP-8質粒轉染HT-29細胞后能高效表達AQP-8，而轉染GFP-N1空載體的陰性對照組與正常對照組的細胞相比，AQP-8的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

A

B

2.2 轉染GFP-AQP-8對HT-29細胞增殖的影響 MTT檢測轉染GFP-AQP-8對細胞增殖活力的影響，結果顯示，與轉染和GFP-N1的陰性對照組相比，轉染了GFP-AQP-8的HT-29細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)，提示上調AQP-8的表達可抑制HT-29細胞增殖。轉染GFP-N1空載體的陰性對照組與正常對照組的細胞相比，增殖抑制率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 轉染GFP-AQP-8對HT-29細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測轉染GFP-AQP-8對HT-29細胞凋亡的影響，結果顯示，與轉染和GFP-N1的HT-29的陰性對照組相比，轉染了GFP-AQP-8的HT-29的細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，提示上調AQP-8的表達可促進HT-29細胞凋亡。轉染GFP-N1空載體的陰性對照組與正常對照組的細胞相比，細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 HT-29細胞增殖抑制率和細胞凋亡率無變化 ±s

注：與GFP-N1組比較，*P<0.05

2.4 轉染GFP-AQP-8對HT-29細胞IAPs家族成員表達的影響 Real Time-PCR和Western blot分別檢測HT-29細胞IAPs家族成員c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA和蛋白表達，結果顯示，與轉染GFP-N1的陰性對照組相比，轉染了GFP-AQP-8的HT-29細胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表達水平下降(P<0.05)，NIAP表達變化不明顯(P>0.05)，轉染GFP-N1空載體的陰性對照組與正常對照組相比，各因子表達差異無統計學意義(P>0.05)。圖2～4。

圖2 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA 表達的變化

圖3 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表達的變化

圖4 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表達的變化(Western blot)

3 討論

細胞凋亡是細胞內正常的生理過程，可以消除機體內有害細胞，防止細胞的過度增殖。可見，凋亡是機體維持正常細胞功能的關鍵。而腫瘤的發生機制之一是細胞凋亡異常導致細胞的過度增生。近年來，一組廣泛存在于多種細胞內、具有抑制凋亡作用，被稱為凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的一類內源性凋亡抑制蛋白逐漸被關注。該家族成員具有結構同源性，與腫瘤、神經細胞凋亡有關，在人體內的過度表達可導致細胞凋亡不足最終形成腫瘤。以IAPs為靶點的治療可為臨床腫瘤治療提供新思路。

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是特異的轉運水分子的蛋白家族，主要功能是調節水進出細胞。在腫瘤細胞的高代謝過程中，水通道蛋白發揮這重要的作用。已有研究表明，AQPs表達與細胞凋亡密切相關，通過直接或間接改變AQPs表達可影響凋亡過程[5,6]。

然而，AQPs家族成員的表達模式不盡相同，比如在結腸癌組織中， AQP-5表達上調，AQP-8表達下調[7]。此外，AQP-8在結腸癌組織中低表達，在星形細胞瘤組織中AQP-8則高表達[8]。AQP-8在結腸癌組織中表達下調，且與淋巴結轉移及TNM分期相關[9]，提示AQP-8在人結腸癌的發生、發展及轉移的過程中可能發揮重要作用。目前，AQP-8 在結腸癌中表達下調的機制研究相對較少。本研究通過體外過表達的方式，首次研究AQP-8對HT-29細胞凋亡及IAPs表達的影響。

本研究發現，過表達AQP-8可抑制HT-29細胞生長，促進其凋亡。細胞是否凋亡取決于促凋亡和抑凋亡蛋白之間的平衡，促凋亡蛋白表達增高和/或抑凋亡蛋白表達降低均可促進細胞凋亡。IAPs 蛋白通過與執行凋亡的酶類Caspase3/7/9結合，抑制其催化活性，阻斷細胞凋亡進程。本文明確了過表達AQP-8表達能促進凋亡后，接著對IAPs家族蛋白的表達進行檢測。c-IAP1和c-IAP2可直接抑制Caspase的活性[10]。XIAP的作用廣泛、穩定、高效，被認為最有效的Caspase抑制劑[11]。NIAP結構和功能與其他成員差別較大，大多關于NIAP的研究集中于神經系統。不過，已有研究顯示，乳腺癌中NIAP高度表達，且與預后相關[12]。Livin高表達于多種腫瘤，可通過抑制Caspase和激活TAK1/JNK1通路抑制細胞凋亡[13]。Survivin也是作用較強的凋亡抑制蛋白，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。我們的結果表明，過表達AQP-8不同程度下調了c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的表達，但不影響NIAP表達，表明HT-29細胞中還存在其他分子調控IAPs家族成員的表達。

綜上所述，過表達AQP-8可能通過下調c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表達誘導HT-29細胞凋亡，本研究為AQPs對結腸癌的作用研究及靶向性治療提供了新的依據。

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本刊編輯部

EffectofAQP-8oncellapoptosisandexpressionofIAPsinhumancoloncancerHT-29cellsinvitro

LIJianqiang*,ZHANGHongrui*,SHIXiaoming,etal.

*DepartmentofSurgery,XinleSocialInsuranceWorkers’Hospital,Hebei,Xinle050700,China

ObjectiveTo investigate the effects of aquaporin-8 (AQP-8) on cell apoptosis and expression of inhibitors of apoptosis proteins(IAPs) by means of eukaryotic expression vector that expresses AQP-8 in human colon cancer HT-29 cells in vitro.MethodsHuman colon cancer HT-29 cells at logarithm growth period were used in the experiment.AQP-8 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into HT-29 cells.Western Blot was used to detect the transfection efficiency;MTT assay was used to detect the cell growth inhibition rate;flow cytometry(FCM) was used to measure the cell apoptosis rate.The expression levels of mRNA and protein of IAPs including c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP,Survivin and Livin were detected by fluorescence quantitative Real-time RT-PCR and Western Blot.ResultsThe results by Western Blot showed that the expression levels of AQP-8 were significantly up-regulated in colon cancer HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection (P<0.05).MTT analysis showed that the proliferation inhibition rate was increased significantly in HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection,as compared with that in GFP-N1 control group (P<0.05).FCM analysis showed that GFP-AQP-8 transfection obviously induced HT-29 cell apoptosis (P<0.05).The results of fluorescence Real-time quantitative RT-PCR and Western Blot showed that the expression levels of mRNA and protein of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin,and survivin in HT-29 cells were significantly decreased by AQP-8 overexpression (P<0.05).However,the expression levels of NIAP mRNA and protein had no obvious change (P>0.05).ConclusionThe overexpression of AQP-8 can inhibit growth of HT-29 cell and can induce HT-29 cell apoptosis by down-regulating the expression levels of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin and survivin.

aquaporin-8;colonic neoplasms;apoptosis;inhibitor of apoptosis proteins

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.22.005

050700 河北省新樂市社會保險職工醫院外科(李建強、張宏蕊)；河北省人民醫院普外二科(石曉明、呂柏楠)

呂柏楠，050051 石家莊市，河北省人民醫院；

E-mail: shixiaoming1999@126.com

R 753.3+5

A

1002-7386(2014)22-3378-04

2014-05-15)