丹參注射液超聲霧化前后三種成分的質量分析*

★ 韓飛 肖雄* 夏夢欣 李瀚南 羅曉健

(1.江西中醫藥大學 江西 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術國家工程中心 江西 南昌 330006)

丹參注射液具有活血化淤、理氣開竅、養血安神、調經止痛、涼血消癰之功效，同時還具有擴張血管、增進冠狀動脈血流量的作用[1,2]。臨床上主要用于治療胸悶、心悸、心絞痛，急慢性心肌梗塞，缺血性腦中風，腦梗塞或中風后遺癥等病癥。

近年來，有大量文獻報道丹參注射液可采用超聲霧化吸入的方式治療毛細支氣管炎、急性肺炎、咽炎，甚至心絞痛等疾病，并取得了較好的療效[3-7]，但目前大多數報道只關注其霧化吸入的實際療效，而很少從制劑基礎研究的層面上去探討其霧化吸入的可行性，本文建立了同時測定丹參注射液超聲霧化液中原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含量檢測方法，并對比超聲霧化前后三種成分含量的變化，初步研究了丹參注射液霧化吸入的可行性。

1 儀器與試劑

魚躍牌4021AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，蘇藥管械準字2002第223)；EPED-20TH純水器(上海精密儀表有限公司)；KQ5200DA超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司，感量0.01mg)；Agilent-1200高效液相色譜儀：Agilent-1200泵，VWD檢測器，Agilent-1200化學工作站。

原兒茶醛對照品，丹酚酸B對照品，丹參酮ⅡA對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所，批號110810-201007，111562-201111，110766-201019)；丹參注射液(上海中西制藥有限公司，國藥準字Z31020345，規格2mL/支)；甲醇(色譜純，上海星可化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A(250mm×4.6mm，5μm，美國菲羅門)；流動相 甲醇(B)-0.1%磷酸水(A)按表1的程序梯度洗脫；流速1.0mL/min；進樣量5μL；柱溫30℃；檢測波長280nm；原兒茶醛的保留時間(tR)2.368min，丹酚酸B的保留時間(tR)3.471min，丹參酮ⅡA的保留時間(tR)11.582min。在上述色譜條件下，三種成分與相鄰成分有較好的分離，各成分的理論塔板數均大于5000，色譜圖見圖1。

表1 流動相洗脫程序表

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品適量，色譜甲醇溶解，置10mL容量瓶中，稱重，超聲20min，放冷，甲醇補足失重，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得原兒茶醛(0.146mg/mL)、丹酚酸B(0.096mg/mL)、丹參酮ⅡA(0.343mg/mL)的混合對照品溶液。

2.2.2 丹參(甲醇)溶液的制備 精密量取4.0mL丹參注射液(批號：20140315)，色譜甲醇溶解，置50mL容量瓶中，稱重，超聲兩次，每次15min，放冷，甲醇補足失重，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得丹參(甲醇)溶液。

1.原兒茶醛；2.丹酚酸B；3.丹參酮ⅡA

2.2.3 丹參注射液超聲霧化液的收集 取干燥的錐形瓶一個，置于裝滿500mL水的燒杯中，冷凍12 h，取出，將同口徑的霧化導管接于錐形瓶上，密封膜纏封，經檢查氣密性良好。大霧化杯中裝入約500mL超純水，小霧化杯中加入2.2.2項下制備的150mL溶液，蓋上頂蓋，頻率調至1.7MHz±10%；霧化量調至4mL/min；打開電源，霧化30min后，關閉電源，轉移至40℃恒溫水浴鍋中加熱，收集所得霧化液，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得丹參注射液超聲霧化液。

2.4 線性關系考察 分別精密量取原兒茶醛(0.146mg/mL)、丹酚酸B(0.096mg/mL)、丹參酮ⅡA(0.343mg/mL)對照品溶液，各0.1，1，2，4，6，8，10mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容，分別精密吸取溶液各10μL，注入色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，結果表明在進樣量范圍內線性關系良好，見表2。

表2 三種成分線性回歸方程

2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下對照品溶液10μL，在上述色譜條件下，連續進樣6次，測定峰面積，結果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積相對標準偏差(RSD)分別為1.743%，1.430%，1.288%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 按2.2.2和2.2.3項方法平行制成6份超聲霧化液(批號20140323)，在上述色譜條件下，進樣10μL，測定峰面積，結果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.257%，1.792%，1.318%，表明該方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一超聲霧化液(批號20140323)10μL，分別于0，2，4，8，12，24 h，在上述色譜條件下，測定峰面積，結果顯示原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.191%，1.223%，1.607%，表明超聲霧化液樣品在24h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取18份任意批號的丹參注射液，分成3組，每組6份，分別加入各對照品適量，按2.2.2和2.2.3項的方法制備成樣品溶液，精密吸取樣品溶液10μL，在上述色譜條件下，測定峰面積，各成分回收率在98.03%～101.66%，RSD<2%，結果見表3。

2.9 樣品測定 按2.2.1項方法制備成供試品五批，在按照2.3項方法制備成超聲霧化液，精密吸取10μL，在上述色譜條件下測定，按照外標法計算各成分的含量，結果見表4。

2.10 超聲霧化前后三種成分含量變化 按照2.2.2和2.2.3項的方法，各制備一批樣品溶液，分別吸取上述兩種溶液各10μL，在上述色譜條件下測定，記錄色譜峰面積，測定各成分的含量等，見表5，圖2。

表3 加樣回收率實驗結果

表4 不同樣品三種成分測定結果 /mg·mL-1

表5 霧化前后各成分含量變化 /mg·mL-1

C.霧化前色譜圖；D.霧化后色譜圖

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗根據文獻報道[9-12]曾嘗試過乙腈-水(73∶27)，甲醇-0.5%磷酸溶液(4∶96)，甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)，甲醇-水-冰醋酸(21∶78∶1)等流動相，結果分離效果均不好。最終確定采用甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脫(表1)，此流動相可同時分離三種成分，且該方法簡便、準確，重復性好，分離度高，所用時間僅為30min。

3.3 收集裝置的選擇 在現用裝置前曾嘗試連接冰冷凍過的冷凝管，但霧化后小液滴的溫度較低，且為液態，而非氣態，所以使用熱交換法使其冷凝的方式幾乎無效，故采用本實驗裝置，使小液滴在相對封閉的環境中達一定壓力從而凝聚為大液滴而形成霧化收集液。另霧化管中亦有霧化液殘留，收集量可觀，約占最終收集液的90%。同時，霧化過程中，頂蓋出霧口有回流現象，故小霧化杯中存留的大量藥液有一部分也經過了霧化過程，符合霧化吸入的條件。

3.4 超聲霧化參數 本實驗所采用的超聲霧化參數(超聲頻率：1.7MHz±10%；霧化量：4mL/min；霧化時間：30min)，參考了相關文獻[5,7]，與臨床上采用的參數基本一致，具有一定的代表性，但霧化的方式不同，如采用氧驅動霧化吸入，三種成分的含量是否變化還有待于進一步研究[13,14]。

3.6 超聲霧化前后的變化 通過對比丹參注射液霧化前后三種成分的變化發現，其含量的改變極小，出峰數基本相同，由圖2，表5可知，霧化后出峰數甚至多出2個，出峰時間集中在2.5～5min。分析原因可能是經過超聲霧化后，促進了樣品中水溶性成分的溶解，使得原本在甲醇中溶解度不大的成分可在流動相中洗脫，故產生了“多峰現象”，但總體來說，其峰面積小于7，含量幾乎可以忽略不計。此結果為探討丹參注射液霧化吸入給藥的可行性，提供了初步的實驗依據。

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