微生物傳感器的發展及其在環境監測中的應用

付 強 林初文 陳 群

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州256600；2.北京尚洋東方環境科技股份有限公司，中國 北京100081）

0 引言

由于人們在追求經濟效益的同時對環境保護的意識不夠，環境污染變得突出，但傳統的檢測方法通常需要一定的分析技術，專業的實驗室，人們需要找到一種簡單，快速，便攜的方法來檢測各種有機和無機化學污染物，生物傳感器可很好的解決這個問題。 根據生物傳感器中所用分子識別元件上的敏感物質不同， 可以將生物傳感器分為：酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、細胞傳感器。其中酶傳感器和微生物傳感器研究得最多，應用也最為廣泛。 本文主要介紹微生物傳感器的發展及其在環境檢測中的應用。

1 微生物傳感器的發展過程

微生物傳感器是指利用一定的固定化方法將生物敏感元件（對特定污染物有感應能力的微生物菌株）與具有信號轉換功能的介質相連，并借助一定的設備將信號放大輸出。 由于微生物傳感器的核心部分是具有生物活性的微生物細胞，而微生物在其數量、大小、繁殖、遺傳改造等方面均具有獨特的優勢，因此可以滿足環境監測中快速簡單、原位、低成本的要求。

1975 年Devis[1]制成了第一支微生物傳感器。 在微生物傳感器研制中最關鍵的是微生物的固定技術，固定后的微生物應盡可能保證細胞活性和避免細胞從膜中流失， 以延長微生物傳感器的使用壽命，傳統的生物材料固定方法包括物理吸附、共價鍵合、交聯到一定的載體基質上或包埋于有機聚合物的基質中，然而這些方法都存在穩定期短和固定時引起微生物的損傷等缺陷。

納米技術的出現提供另一種更好的固定方法，納米管與聚合物復合材料用于電化學傳感具有很多優點，如制備簡單，易于制成同一厚度的膜等，可以有效地提高生物傳感器的重現性。 導電聚合物(如聚吡咯、聚苯胺、聚嚷吩等)制成的導電聚合物膜具有良好的導電性，易于電子在生物活性物質與電極之間傳遞， 可用于制作第三代生物傳感器。 10 年前已經出現的微生物燃料電池（(Microbial FuelCell，MFC)）技術正進入快速發展時期，這些進步均有助于促進了微生物傳感技術的發展。

2 在環境監測中的應用

2.1 大氣檢測

SO2是酸雨酸霧形成的主要原因， 傳統的檢測方法很復雜。Sasaki（1997）將一種氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)制成微生物傳感器，可以監測酸雨中的硫酸鹽。王曉輝等[2]分別以氧化硫硫桿菌和多功能硫桿菌為分子識別元件，制備了硫化物和亞硫酸鹽微生物電極，實驗證明，電極的響應時間為3～6 分鐘,以氧化硫硫桿菌為分子識別元件的電極選擇性好， 它對S2-的線性范圍為0.06～3.0mg/L，對SO32-的線性范圍為0.7～32mg/L。 但對于此類傳感器后續報道不多。 此外還有用于NO2檢測的微生物傳感器[3]。

2.2 水質監測

2.2.1 BOD 檢測

生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand)簡稱BOD，是水體中微生物分解有機物的過程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的測定對控制水體污染具有更重要的意義， 傳統測定BOD 的方法需要5 天，用傳感器測定只需十幾至幾十分鐘，胡磊等[4]采用接枝二茂鐵為介體的微生物傳感器測量污水的BOD。 結果表明，傳感器的線性范圍為2～300mg/L，連續測量20 個樣品的精密度為4.2%，能連續工作35天。 通過對實際水樣的測試表明，測得的BOD 與BOD5，具有良好的相關性。

雖然微生物電極法可縮短測定時間，但微生物固定化膜的制作工藝復雜且容易污染，同時單一菌種底物利用范圍有限，在一定程度上限制了微生物電極的使用。 近年來，人們利用從污水和活性淤泥中富集的電化學活性微生物， 構建了多種有介體或無介體微生物燃料電池，同時發現電流（電壓）或電子庫侖量與電子供體的含量之間存在對應關系， 因此微生物燃料電池能用于某些底物含量的測定， 如廢水BOD[5]以及有毒物質[6]等，其中用于廢水中BOD 測定的研究最為成熟。

2.2.2 重金屬檢測

重金屬污染廣泛存在于環境中，它能通過生物富集作用對動植物及人類產生危害。利用分析化學方法檢測重金屬離子對其生物危害缺乏直接檢定， 生物傳感器檢測重金屬離子吸引了越來越多的研究興趣。

發光微生物傳感器是目前生物毒性測試中研究最多的微生物傳感器之一。最常用的生物發光系統是用于水體毒性實驗的Microtox 法評價。 早在1995 年國家環境保護總局就頒布了水質急性毒性的測定發光細菌法行業標準。李書鉞[7]以明亮發光桿菌作為指示生物，研制的傳感器將可同時分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對發光細菌的毒性作用，該傳感器與傳統實驗方法具有較高的相關性。

Wang 等[8]采用嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.)微生物傳感器毒性分析系統，對Hg2+、Cu2+、Zn2+、Cr6+、Cd2+、Pb2+、Co2+等重金屬和鄰氯苯酚(2-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、鄰硝基酚(2-NP)、對硝基酚(4-NP)、四環素、十二烷基苯磺酸鈉(LAS)等有機物的生物急性毒性進行分析。 試驗結果表明，基于對數生長后期和穩定期的嗜冷桿菌微生物傳感器具有良好的毒性分析性能。Amaro 等[9]則以四膜蟲（Tetrahymena thermophila MTT1、MTT5）金屬硫蛋白激活子的真核生物熒光素蛋白基因作為信號載體，開發全細胞生物傳感器，其檢測重金屬離子的靈敏性可與原核生物相當。

基因工程微生物在重金屬離子檢測方面也發揮了作用。Ravikumar 等[10]通過生物技術手段將對Zn2+、Cu2+敏感的兩種啟動子融合為雙標記報告蛋白，開發出檢測Zn2+、Cu2+的微生物傳感器，最低檢出濃度分別為16μM 和26μM。 Liu 等[11]從惡臭假單胞菌篩選出對Zn2+的特異性啟動子czcR3 融合到增強型綠色熒光蛋白(egfp)，研制出用于特異性的檢測Zn2+含量的生物傳感器。Singh 等[12]固定小球藻于玻璃碳電極膜上研制微生物傳感器監測Hg2+。 具有良好的響應時間、和持久性，電極響應的線性Hg2+濃度范圍為10-14M～10-6M，可保持14 天使用期。

用死去的生物被動吸收重金屬是一種更有效、經濟、簡單的方法。死細胞與活細胞相比，不需要營養，易于處理和儲存，耐高毒性的反應環境。將銅綠假單胞菌烘干后構建微生物傳感器檢測重金屬Pb2+，得出其對Pb2+的線性響應范圍從1.0μM 到2.0μM，最低檢測量為0.6μM[13]。

2.3 農藥污染監測

我國是一個農業大國， 農藥是農業生產中十分重要的生產資料，而有機磷農藥(organophosphates, OPs)是目前應用范圍最廣，使用量最大的農藥之一。 由于過度使用OPs 引發的環境問題日益嚴重，與此同時人們對于食品安全問題也日益關注。 OPs 可以與人體內的膽堿酯酶(cholinesterase, ChE)迅速結合，形成磷酰化膽堿酯酶，使酶失去活力，引發中毒、致畸等癥狀。 要預防和處理OPs 引起的環境和食品污染等問題，使用快速、高效、靈敏、準確的檢測方法是十分重要的。

Tang 等[14]制備的微生物電化學傳感器，可迅速檢測對硫磷、對氧磷、甲基對硫磷濃度。 Anu Prathap 等[15]利用重組大腸桿菌制備測定有機氯農藥（俗稱林丹）的檢測的微生物傳感器，其測定的線性范圍為2～45ppt，且具有高度特異性。 Liu 等[16]開發一種利用熒光假單胞菌檢測苯酚和硝基酚的微生物傳感器

2.4 其他監測

三氯乙烯（TCE）用作有機溶劑和工業脫脂劑，可引起中樞神經系統損害。TCE 可被惡臭假單胞菌產生的甲苯雙加氧酶酶降解為為乙醛酸和甲酸離子，可用儀器檢測。 基于這種反應機理開發的微生物傳感器可檢測出20μg L-1～150μg L-1含量的TCE[17]。

郭珺等[18]從沼氣池中分離得到一株能以甲醇為唯一碳源和能源生長的菌株M211， 經鑒定為嗜有機甲基桿菌(Methylobacterium organophilium)，傳感系統在0.02%～1% (V/V)甲醇含量范圍內測定，響應時間小于20min，檢出限為0.27mg/L，溶氧消耗量同甲醇含量呈線性關系，該測定體系不易受其它干擾物質影響，檢測結果與實際樣品濃度一致，該測定體系具有較強的選擇性，及良好的重現性和穩定性，具有較好的應用前景。

甲醛含量已成為當今居室、食品、紡織品中污染監測的一項重要安全指標。 湯鴻雁等[19]以枯草芽孢桿菌為固定化菌株研制出甲醛微生物傳感器，經測試，與乙酰丙酮分光光度法的測定結果有很好的一致性。

3 結語

相對于酶傳感器，微生物傳感器最大的優點就是成本低、操作簡便、設備簡單，所以應用市場潛力巨大，但它自身也存在了一定的的缺陷，比如反應時間比酶傳感器要長，由于多酶體系的存在，有可能對復雜樣品產生非特異性響應等。 有待我們進一步完善。 開發新的固定化技術，利用微生物育種、基因工程和細胞融合技術研制出新型、高效耐毒性的微生物傳感器是該領域科研人員面臨的課題。相信微生物傳感器作為一個具有發展潛力的研究方向。定會隨著生物技術、材料科學、微電子技術等的發展取得更大的進步，并逐步趨向微型化、集成化、智能化。 最后，檢測不是目的，美好的環境需要人們共同呵護。

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