非小細胞肺癌組織中EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達的關系

田玉旺 許春偉 高文斌 張玉萍 李 揚 亓崠東

在全球范圍內，肺癌已躍居為發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1-2]。肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占80～85%[3]。EML4-ALK是2007年發現的由棘皮動物微管相關蛋白 4(echinoderm microtubule associated protein-like 4,EML4)與漸變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因融合而成的肺癌特異性融合基因，其在肺癌患者中的陽性率約為3%～8%[4]。EML4-ALK融合基因陽性具有與EGFR基因突變互斥性。NSCLC患者中最常見的EML4-ALK融合基因變異體是變異體1、2和3。變異體1的陽性率約為33%，變異體3的陽性率約為29%，變異體2的陽性率約為9%，這3種變異體占所有變異體的大多數，其他的多種變異體所占比例均較低[5-11]。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TYMS)編碼的酶是dTMP從頭合成的限速酶，在DNA合成、復制和修復中起著極其重要的作用[12]，它可導致DNA斷裂并使細胞死亡，成為目前部分抗腫瘤藥物重要的有效靶點。研究表明多種惡性腫瘤組織TYMS活性顯著高于正常組織[13]。通過調節p53表達影響周期從而影響腫瘤細胞的增殖，TYMS與腫瘤增殖狀態相關[14-15]，TYMS過表達的腫瘤細胞群具有生長優勢潛能，提示TYMS高表達和不良預后呈負相關。

肺癌患者TYMS低表達時，其對一線化療藥培美曲塞(pemetrexed,ALIMTA)的有效性提高[16-17]。本研究通過多中心研究回顧257例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達情況并對其相互其關系進行分析，旨在了解NSCLC患者EML4-ALK融合基因與組織中這種耐藥基因表達情況的關系，為進一步探索EML4-ALK融合基因患者更有效的個體化治療方案。

材料與方法

一、實驗材料

1. 資料來源：收集解放軍北京軍區總醫院、大連大學附屬中山醫院、山東省濰坊市人民醫院2004年至2013年間進行手術，術后病理診斷為肺腺癌且術前未經化療、放療及生物免疫治療的組織蠟塊標本257例(其中解放軍北京軍區總醫院103例，大連大學附屬中山醫院58例，山東省濰坊市人民醫院96例)，進行EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA檢測。

2. 主要試劑和儀器：DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，EML4-ALK基因表達檢測試劑盒(福建廈門艾德有限公司)，腫瘤相關基因表達量相對定量檢測試劑盒(TYMS，福建廈門艾德有限公司)，核酸蛋白質濃度測量儀B-500(上海創萌生物科技有限公司)，Mx3000P實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)。

二、研究方法

1. 實時熒光定量PCR檢測EML4-ALK融合基因：取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟；按照提取基因組RNA試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織RNA，應用分光光度計檢測所提取RNA 的純度和濃度。按照EML4-ALK基因表達檢測試劑盒(福建廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，在ABI7500 實時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進行擴增，該試劑盒包含擴增EML4-ALK基因9種融合突變的引物及探針。

2. 實時熒光定量PCR檢測NSCLC組織中TYMS mRNA的表達：取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟；按照提取基因組RNA試劑盒(德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織RNA，應用分光光度計檢測所提取RNA 的純度和濃度。按照腫瘤相關基因表達檢測試劑盒(TYMS，福建廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，ABI7500 實時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進行擴增。用絕對定量法，以β-actin為內參基因對TYMS基因mRNA表達進行檢測。TYMS標準均值為4.21×10-3(福建廈門艾德有限公司)。

三、統計學方法

所有數據采用SPSS19.0統計軟件，結果運用χ2及Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05，并設定P值為雙側分布，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、EML4-ALK融合基因和TYMS mRNA表達與患者臨床特征的關系，見表1、圖1。

257例NSCLC組織中EML4-ALK融合基因陽性11例(4.28%)；不吸煙者中EML4-ALK融合基因陽性率7.0%，顯著高于吸煙者(P=0.007)，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及臨床分期等臨床特征無關。257例NSCLC組織中TYMS mRNA高表達者163例(63.42%)，低表達者94例(36.58%)；TYMS mRNA表達水平與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及臨床分期等臨床特征無關。

表1 EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達與患者臨床特征間的關系

圖1 TYMS低表達

二、EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達水平間的關系，見表2。

11例EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表達者8例(72.73%)；246例EML4-ALK融合基因陰性的NSCLC患者中，TYMS mRNA低表達者86例(34.96%)，EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者傾向于TYMS mRNA低表達(72.73%vs. 34.96%，P<0.05)。

表2 NSCLC組織中EML4-ALK融合基因與TYMS mRNA表達水平間的關系

討 論

EML4-ALK基因融合的選擇性抑制劑克唑替尼(crizotinib，商品名：賽可瑞)在NSCLC患者的臨床實驗中，由于Ⅰ期、Ⅱ期的臨床試驗收到了較好的效果，且不良反應小，患者耐受性好，目前已進入Ⅲ期臨床實驗。但2010年，Choi等[18]報道了1例EML4-ALK陽性的NSCLC患者，在經過5個月克唑替尼治療后產生繼發耐藥，并發現2種點突變，突變位點為(C1156Y和L1196M)。因此進一步探索克唑替尼原發或繼發耐藥對患者的個體化治療方案顯得非常具有實用價值和現實意義[19]。

本研究結果顯示，Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因陽性率為4.28%(11/257)，在不吸煙患者中較高(P<0.05)，與國內至今已報道的四個研究中，EML4-ALK融合基因陽性率為6.40%(31/484)相比略微偏低[8,20-22]。本組NSCLC患者中，TYMS的高表達率為63.42%(163/257)，與Ganda等[23]研究結果基本一致，且TYMS表達水平均與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結轉移情況和病理分期等臨床特征無關。

本研究發現，NSCLC患者中，EML4-ALK融合基因與TYMS表達水平有關(P<0.05)，EML4-ALK融合基因陽性患者TYMS呈低表達者較多?；熌褪苁菍е履[瘤治療失敗的主要原因之一。短期應用培美曲塞化療后，可能出現TYMS誘導，而導致TYMS過表達、催化活性升高，使腫瘤細胞耐藥。TYMS高表達使增殖期細胞DNA合成修復能力增強，從而使肺癌細胞不易被化療藥物殺死導致耐藥，TYMS低表達卻不易形成對培美曲塞耐藥，增加了化療有效的機會。這可能是EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者對化療有較高的反應率內在機制的一個理論依據。

本研究初步明確了NSCLC患者EML4-ALK融合基因陽性患者中TYMS傾向低表達，推測EML4-ALK融合基因陽性患者應用培美曲塞化療有效率高，但其內在的分子機制尚需進一步研究。本研究組以對化療藥中的鉑類和他濱類藥物耐藥基因與EML4-ALK融合基因相互關系進行研究，而此次僅對培美曲塞耐藥基因與EML4-ALK融合基因相互關系進行了研究，并未對一線化療藥中的微管類藥物耐藥基因TUBB3進行研究。因此期待關于EML4-ALK融合基因與微管類耐藥基因TUBB3的研究和進一步探索更有效的個體化治療方案，特別是對EML4-ALK融合基因選擇性抑制劑克唑替尼原發或繼發耐藥患者的個體化治療方案的研究報道。

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