急進高原大鼠肺泡Ⅱ型細胞肺水轉運功能與肺損傷的關系

吳 岳 王海燕 張 偉 趙海龍 董紅梅 王 靜

肺泡Ⅱ型細胞(ATⅡ)占肺泡上皮的60%，對肺泡正常結構和功能的維持具有非常重要的作用。已有研究提示，ATⅡ是肺泡上皮細胞的祖細胞，也是肺泡上皮的干細胞[1]。在細胞的更新及損傷的修復過程中，ATⅡ既可以分化成Ⅰ型細胞，還可通過進行有絲分裂來補充自身數量。相關研究表明，ATⅡ細胞上存在鈉水通道，它與肺泡內液體的產生和清除關系密切，在肺水的清除中起著維持細胞內外液體平衡的作用[2]。但ATⅡ與高原低氧肺損傷關系的研究少見。為此，我們觀察了急進高原不同時間大鼠肺臟的細胞學形態和超微結構變化，并測定了肺泡液體清除率(alveolar liquid clearance, ALC)，旨在探討ATⅡ肺水轉運功能與高原肺損傷的關系。

材料與方法

一、實驗材料

從西安(海拔400 m)購買Wistar雄性大鼠60只，體重210～230 g，隨機分為4組，每組15只。對照組(T0組)在平原(海拔400 m)進行實驗檢測，另外3組在10 h內快速運送到海拔4300 m的青海省瑪多縣，分別于急進高原24 h(T1組)、72 h(T2組)、168 h(T3組)進行實驗。

二、研究方法

1. 氣管插管和頸動脈插管:檢測前1 h用3%戊巴比妥鈉(150 mg/kg)腹腔內注射麻醉。麻醉后進行氣管切開插管，采用小動物呼吸機(Model 683)行呼吸末正壓通氣(PEEP為2.20 mmHg)，吸氧濃度1.0，呼吸頻率60次/min，潮氣量10 ml/ka，氣道壓低于11.0 mmHg。右側頸動脈行PE50導管插管，用血流動力學檢測儀(CARDIOMAX-Ⅱ)監測血壓。術后靜置1 h，并且把心率維持在300次/min以下。

2．灌注液的配置：按文獻方法配置5%小牛血清、乳酸鈉林格氏液加伊文思藍(1 g/L)和I125-白蛋白灌注液[3]。移去呼吸機接頭，用5 ml注射器將灌注液10 ml/kg[每只鼠按74kBq(1Ci=3.7×107kBq)]和0.5 ml空氣注入大鼠肺內，連接呼吸機，繼續通氣。灌注前及灌注后10、30、60 min分別記錄大鼠心率、血壓，并經頸動脈插管抽取動脈血行血氣分析。

3. ALC計算：1 h后放血活殺大鼠，取出完整肺。將干燥PE50導管(becton dickinson, US)通過氣管插至肺邊緣部位，然后吸出肺泡內液體，盛于已經稱重過的200 μl離心管內(1/1000 g精密天平)，再次稱量離心管重量，兩者之差即為吸出液體量(Mf)。用R計數儀(SN682型，上海)讀取1 min r計數(G)，按公式計算每毫克放射量(Cf)。再取約100 μl灌注液原液，同樣方法測量原液的Gi和Mi，并計算Ci和ALC。利用下列公式計算ALCCi=Gi/Mi；Cf=Gf/Mf；ALC(%)=(1-Ci/Cf)×100%。

4. 光鏡和電鏡觀察：各組大鼠活體解剖，觀察肺組織大體形態學變化。取一側肺，用10%甲醛緩沖液固定，然后石碏包埋和切片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色。Olympus光學顯微鏡下觀察肺組織形態學變化。部分肺組織標本用4%戊二醛及1%鋨酸混合液固定后，分別進行梯度乙醇脫水，經環氧樹脂包埋并行超薄切片后，在電鏡下觀察肺組織超微結構變化。

三、統計學方法

結 果

一、各組大鼠ALC比較

T1組、T2組大鼠ALC(分別為22.60±3.41%、25.28±6.30%)較T0組大鼠(41.14±9.36%)顯著降低(均P<0.05)，T3組(45.52±10.05%)與T0組比較無統計學意義(P>0.05)。

二、光鏡觀察

光鏡下見T1、T2組大鼠肺組織炎癥反應明顯，肺泡壁毛細血管充血水腫，肺泡腔內有液體和較多炎細胞聚集。肺組織中偶見有單個散在分布的凋亡細胞，周圍無炎性細胞浸潤。肺泡Ⅱ型上皮細胞體積較小，呈立方形，細胞核較大呈圓形，核染色質致密濃縮，整個細胞核呈藍黑色，鏡下見部分組織出現壞死，細胞呈現核碎裂，胞漿呈淡紅色。T0組及T3組大鼠肺臟病變相對較輕。

三、電鏡觀察

T1組、T2組大鼠肺臟大多數細胞的胞膜微絨毛減少或消失，部分Ⅱ型肺泡上皮細胞體積縮小、變圓。有些細胞胞漿嗜俄性板層小體數量減少，排空增加；細胞核呈現多形性，并見有假包涵體形成；可見染色質聚集、靠近核膜和核被膜內陷或外折等征象，見圖1、圖2。T0組及T3組大鼠肺超微結構變化輕于T1及T2組。

圖1 肺泡Ⅱ型上皮細胞核染色質固縮

圖2 左下方為肺泡Ⅱ型上皮細胞，胞質有大量已經排空的板層小體，核染色質濃縮，固縮

討 論

ATⅡ細胞具有跨模主動運轉功能和分泌生物活性物質的能力，在肺上皮更新以及組織損傷修復過程中起著干細胞的作用[1]。同時，ATⅡ細胞又因為其在不同的生理條件下能表達主要組織相容性復合物Ⅱ類分子，炎癥介質和分泌細胞因子參與炎癥反應，而被看作是重要的免疫調節細胞之一，具有調節免疫以及防御的作用。

近年對ATⅡ功能的深入了解使人們對急性肺水腫形成機制有了新的認識。既往研究有資料表明肺泡兩側壓力差可能是導致急性肺水腫的直接原因。近期有學者發現，肺泡Ⅱ型上皮細胞具有很強的液體轉運能力，對維持肺泡內液體的平衡有著一定的作用 。Folkesson等[4]曾對博來霉素引起大鼠亞急性肺損傷的肺水轉運功能做了連續的觀察，通過檢測I125標記的白蛋白變化量來推算肺泡液體通透性的改變，隨后計算ALC。發現肺損傷后1 h， ALC下降110%，4 h后ALC下降75%，60 d后方恢復正常。并且發現肺泡上皮對蛋白的通透性呈現顯著增加。但肺泡Ⅱ型上皮細胞上鈉離子通道數量減少了52%，說明肺泡液體通過單個細胞轉運能力下降。基于以上實驗，研究者認為肺泡Ⅱ型上皮細胞數量的增加可能是肺水清除率增加的主要原因[4]。

急性肺損傷后的ATⅡ的變化比較復雜。肺泡表面活性物質的合成及分泌功能發生損傷，肺泡內液體轉運能力不足或者肺表面活性物質滅活增加，均可以引起肺泡內外液體失衡，從而引起急性肺損傷。ATⅡ數量的增加和細胞的分化不僅可以修復損傷肺泡的結構，還能有效地促進其功能恢復，進而可能阻止肺損傷的發展。有實驗表明生長因子可以部分促進ATⅡ的增殖，可能為急性肺損傷的治療提供理論依據。本實驗結果提示急進高原大鼠24 h、72 h后ALC明顯下降，究其原因，可能與下列原因有關：①急進高原大鼠受到高原環境包括低氧、高寒的強烈刺激，引起ATⅡ凋亡，導致ATⅡ的數量明顯減少，肺水清除率明顯下降，大量的液體積聚在肺泡腔內，從而引發肺損傷；②急進高原大鼠ATⅡ發生凋亡，呈現細胞膜上的多數微絨毛減少或消失，而且線粒體出現明顯腫脹[5]，板層小體的數量出現了減少、排空增加，形成了假包涵體，同時可見核染色質濃縮。這些變化可能影響了氣血屏障和呼吸膜的完整性，從而導致肺損傷。

ATⅡ除了合成和釋放表面活性物質外，膜上還存在著不同的離子通道如鈣離子通道、阿米洛利敏感的鈉通道(ENaC)、氯通道(CFTR)、鉀通道和Na+-K+-ATP酶、布美他尼敏感的Na+-K+-Cl-共同轉運體等，這些通道共同完成肺泡上皮離子的轉運過程。在這些通道蛋白的研究中，水通道蛋白(aquaporins, AQPs)的研究明顯受到重視，但針對ATⅡ水通道蛋白的研究報道較少[6-7]。種種跡象表明AQPs的變化可能影響肺組織的功能[8-9]。本研究結果提示，急進高原大鼠24 h、72 h ALC明顯下降，可能與鈉水通道的改變有關。至于是哪種水通道蛋白在高原肺損傷的發生機制中起作用以及具體機制尚有待進一步研究。

本實驗顯示，急進高原168 h大鼠(T3組)ALC恢復到平原大鼠(T0組)的水平，可能與ATⅡ的增殖和修復有關，其具體機制尚不清楚。應用某些促進ATⅡ增殖和修復的生長因子，可能對高原肺損傷的治療有益。

參 考 文 獻

1 Barkauskas CE, Cronce MJ, Rackley CR, et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung[J]. J Clin Invest, 2013, 123(7): 3025-3036.

2 吳松林, 毛 璞, 莫紅纓, 等. 人Ⅱ型肺泡上皮細胞的分離培養與表型維持研究[J]. 中國危重急救醫學, 2012, 24(7): 388-389.

3 Wang Y, Folkesson HG, Jayr C, et al. Alveolar epithelial fluid transport can be simultaneously upregulated by both KGF and beta-agonist therapy[J]. J Appl Physiol, 1999, 87(5): 1852-1860.

4 Folkesson HG, Nitenberg G, Oliver BL, et al. Upregulation of alveolar epithelial fluid transport after subacute lung injury in rats from bleomycin[J]. Am J Physiol, 1998, 275(3 Pt 1): L478-490.

5 吳 岳, 趙海龍, 王海燕, 等. 肺泡Ⅱ型細胞凋亡在急進高原大鼠早期肺損傷中的作用[J]. 青海醫學院學報, 2013, 34(4): 233-236.

6 何 琳, 李濤平. 肺泡Ⅱ型上皮細胞鈉通道在肺水清除中信號轉導的研究進展[J]. 國外呼吸雜志, 2007, 27(12): 919-921.

7 吳 岳, 趙海龍, 馬祁生, 等. ATⅡ細胞在急性高原肺水腫中的作用及意義[J]. 青海醫學院學報, 2008, 29(3): 200-201.

8 Ozu M, Dorr RA, Gutiérreaz F, et al. Human AQP1 is a constitutively open channel that closes by a membrane-tension-mediated mechanism[J]. Biophysical journal, 2013, 104(1): 85-95.

9 Almeida C, Nagarajan D, Tian J, et al. The role of alveolar epithelium in radiation-induced lung injury[J]. PloS One, 2013, 8(1): e53628.