阻斷氯離子通道對荷Hep-2細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤生長、細(xì)胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表達(dá)的影響*

余文發(fā)，趙玉林，王 萍，魯保才，馬慧敏，王慧敏

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 衛(wèi)輝 453100 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 鄭州 450052 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院功能檢查科 新鄉(xiāng) 453003

阻斷氯離子通道對荷Hep-2細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤生長、細(xì)胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表達(dá)的影響*

余文發(fā)1)△，趙玉林2)，王 萍3)，魯保才1)，馬慧敏1)，王慧敏1)

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 衛(wèi)輝 453100 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 鄭州 450052 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院功能檢查科 新鄉(xiāng) 453003

△男，1972年3月生，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：頭頸腫瘤的防治，E-mail:yuwenfa197288@aliyun.com

喉腫瘤；氯離子通道；Oct4；CD133；裸鼠；Hep-2

目的：研究阻斷氯離子通道對荷Hep-2細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用及可能機(jī)制。方法以Hep-2細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，應(yīng)用不同濃度(0、10、50、100和150 μmol/L)的氯離子通道阻斷劑(NPPB)處理4周，每組6只。觀察移植瘤體積的變化，采用TUNEL染色檢測移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況，免疫組化法檢測移植瘤組織Oct4和CD133蛋白的表達(dá)。結(jié)果不同濃度的NPPB組間移植瘤體積、細(xì)胞凋亡指數(shù)及Oct4和CD133蛋白的陽性表達(dá)率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.361、126.385,P均<0.05); 與對照組(0 μmol/L NPPB組)相比，50、100和150 μmol/L NPPB組移植瘤體積減小，細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，Oct4和CD133蛋白的陽性表達(dá)率降低(P<0.05或0.005)。結(jié)論體內(nèi)阻斷氯離子通道可抑制荷Hep-2細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低Oct4和CD133蛋白的表達(dá)有關(guān)。

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率及死亡率呈明顯升高趨勢，但其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全明了[1]。研究[2]顯示惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展伴隨細(xì)胞信號傳導(dǎo)的異常，而細(xì)胞信號傳導(dǎo)與離子通道的功能狀態(tài)密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由極少數(shù)具有無限增殖能力的細(xì)胞增殖而形成[3]。Oct4是多能性干細(xì)胞的標(biāo)志，在維持胚胎干細(xì)胞的全能性及多向分化能力方面發(fā)揮著重要作用[4]。CD133也是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物[5]。作者的前期研究[6-7]表明阻斷氯離子通道可抑制體外培養(yǎng)的人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。為進(jìn)一步探討阻斷氯離子通道對喉癌的抑制作用及其機(jī)制，該研究采用Hep-2細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察不同濃度的氯離子通道阻斷劑5-硝基-2-(3苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoate acid, NPPB]對移植瘤生長、細(xì)胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料Hep-2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。30只BALB/C先天性細(xì)胞免疫缺陷nu/nu裸小鼠，雌性，4～6 周齡，體重17～22 g，購自上海實驗動物研究中心。Oct4單克隆抗體(ZM-0233)和CD133多克隆抗體(ZA-0426)均為即用型抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2裸鼠皮下移植瘤模型的建立選取對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS洗滌2次，制成1×108mL-1細(xì)胞懸液備用。在超凈工作臺內(nèi)，以TB空針抽取細(xì)胞懸液注入裸鼠右側(cè)腋部皮下，穿刺點距注射部位1.2 cm，每只鼠皮下接種1點，每點0.2 mL。接種后觀察。接種部位皮下長出粟粒大小的硬結(jié)為移植瘤模型建立成功。接種后每天觀察裸鼠精神、飲食、活動和腫瘤形成情況。

1.3實驗分組接種2周后30只裸鼠均出現(xiàn)粟粒大小腫瘤。隨機(jī)分為5組，每組6只，即對照組和不同濃度NPPB組(10、50、100和150 μmol/L NPPB)。NPPB組每天向腫瘤組織局部注射相應(yīng)濃度的NPPB 50 μL，對照組注射同體積PBS(0.01 mol/L, pH 7.4)，共4周。

1.4移植瘤體積的觀測給藥前和給藥開始后每周用游標(biāo)卡尺測量瘤體長徑(a)和短徑(b)，根據(jù)公式V=1/6πab2計算移植瘤體積。

1.5標(biāo)本的取材治療4周后拉頸處死小鼠，迅速取出腫瘤，分為2部分。一部分用作TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測，另一部分切成大小為0.5～1.0 mm3的組織塊，甲醛溶液固定24 h后常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，用于病理學(xué)診斷和Oct4、CD133蛋白檢測。

1.6移植瘤組織細(xì)胞凋亡檢測依照武漢博士德生物工程公司提供的TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明步驟進(jìn)行。計算凋亡指數(shù)(AI)。

1.7移植瘤組織中Oct4和CD133蛋白的檢測采用免疫組化PV9000二步法進(jìn)行Oct4、CD133蛋白的檢測，分別以肝癌、精原細(xì)胞瘤作為CD133、Oct4的陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。CD133主要表達(dá)于胞膜，在胞漿也有表達(dá)，而Oct4主要表達(dá)于胞核。結(jié)果判斷采用半定量分析法[8]。①按細(xì)胞染色程度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②按陽性細(xì)胞百分比：每例標(biāo)本選取5個高倍視野，計數(shù)100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞，取均值。陽性細(xì)胞百分比<5%為0分，5%～為1分，26%～為2分，≥50%為3分。兩項得分相乘，≤1分為陰性，≥2分為陽性。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較不同濃度NPPB處理4周后移植瘤體積和AI的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用精確概率法比較不同濃度NPPB處理4周后移植瘤組織中CD133和Oct4蛋白的表達(dá)。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組移植瘤生長情況30只裸鼠Hep-2細(xì)胞接種2周后均出現(xiàn)粟粒大小腫瘤，皮下移植部位全部形成類圓形腫瘤，隆起于皮膚表面，成瘤率100%。

2.2各組移植瘤體積比較NPPB能有效抑制喉癌移植瘤的生長，見表1。

表1 各組移植瘤體積比較 cm3

F=7.361,P=0.015；#：與對照組比較，P<0.05。

2.3各組移植瘤組織中AI和Oct4、CD133蛋白表達(dá)的比較見圖1、表2。

圖1 各組移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

表2 各組移植瘤組織中AI和Oct4、CD133蛋白表達(dá)的比較

*:各組間兩兩比較，P均<0.05；△：精確概率法；#：與對照組比較,P<0.005。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，而細(xì)胞離子通道結(jié)構(gòu)和活性的改變與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡亦密切相關(guān)。氯離子通道是較為重要的一種離子通道。氯離子通道阻滯劑可以抑制卵巢癌、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制細(xì)胞增殖[8-9]；在多種細(xì)胞系如SiHa和HeLa中發(fā)現(xiàn)，阻斷氯離子通道可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。另外，肺癌干細(xì)胞中也存在容積激活氯離子通道[12]。

作者觀察了氯離子通道阻滯劑NPPB對裸鼠移植瘤體積及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，隨NPPB作用濃度的增加，裸鼠移植瘤體積減小，細(xì)胞AI升高。人類表達(dá)Oct4基因的成體干細(xì)胞是癌變起源的一種靶細(xì)胞，Oct4在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤形成起始時一些不可逆的基因改變可以阻止Oct4的消失，保留了細(xì)胞異常自我更新的能力，無限制的擴(kuò)增即形成腫瘤。而CD133是傳統(tǒng)血液腫瘤、造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。在急性髓系白血病、肝癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌等腫瘤中，裸鼠移植實驗均證明只占腫瘤細(xì)胞極少數(shù)的CD133+細(xì)胞具有致瘤能力，CD133+細(xì)胞與不良預(yù)后和較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力有關(guān)[13]。衛(wèi)旭東等[14]用免疫磁珠分選技術(shù)從喉癌Hep-2細(xì)胞系分離純化出CD133+腫瘤細(xì)胞，初步證明CD133為喉癌起始細(xì)胞的標(biāo)志之一。該研究結(jié)果表明：喉癌裸鼠移植瘤組織中Oct4和CD133蛋白陽性表達(dá)率在氯離子通道阻斷后均明顯下降。其原因可能為NPPB阻斷后Oct4和CD133信號傳導(dǎo)通路受到影響，進(jìn)而影響喉癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性和分化。但氯離子通道與喉癌發(fā)生發(fā)展的確切關(guān)系仍需更為深入的研究。

綜上所述，阻斷氯離子通道可抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生長，誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低Oct4和CD133蛋白的表達(dá)有關(guān)。

[1]Kitcher E,Yarney J,Gyasi R,et al.Laryngeal cancer at the korle bu teaching hospital accra ghana[J].Ghana Med J,2006,40(2):45

[2]Hatta S,Sakamoto J,Horio Y.Ion channels and diseases[J].Med Electron Microsc,2002,35(3):117

[3]Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J].Nature,2001,414(6859):105

[4]Chen YC,Hsu HS,Chen YW,et al.Oct-4 expression maintained cancer stem-like properties in lung cancer-derived CD133-positive cells[J].PLoS One,2008,3(7):e2637

[5]Auberger J,Dlaska M,Auberger T,et al.Increased CD133 expression in bone marrow of myelodysplastic syndromes[J].Leuk Res,2005,29(9):995

[6]Yu WF,Zhao YL,Wang K,et al.Inhibition of cell proliferation and arrest of cell cycle progression by blocking chloride channels in human laryngeal cancer cell line Hep-2[J].Neoplasma,2009,56(3):224

[7]余文發(fā),趙玉林,張軍輝,等.阻斷氯通道對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2008,15(12):668

[8]Li M,Wang B,Lin W.Cl-channel blockers inhibit cell proliferation and arrest the cell cycle of human ovarian cancer cells[J].Eur J Gynaecol Oncol,2008,29(3):267

[9]Chen L,Wang L,Zhu L,et al.Cell cycle-dependent expression of volume-activated chloride currents in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2002,283(4):C1313

[10]Shen MR,Droogmans G,Eggermont J,et al.Differential expression of volume-regulated anion channels during cell cycle progression of human cervical cancer cells[J].J Physi-ol,2000,529(Pt 2):385

[11]Gauthier NC,Ricci V,Gounon P,et al.Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins and actin cytoskeleton modulate chloride transport by channels formed by the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin VacA in HeLa cells[J].J Biol Chem,2004,279(10):9481

[12]毛張凡,徐小惠,黃杰,等.肺癌干細(xì)胞中存在容積激活氯通道[J].中國病理生理雜志,2012,28(5):944

[13]Beier D,Hau P,Proescholdt M,et al.CD133+and CD133-glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles[J].Cancer Res,2007,67(9):4010

[14]衛(wèi)旭東,周梁,程磊,等.CD133作為喉癌腫瘤起始細(xì)胞標(biāo)志的實驗研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2006,41(12):940

(2013-06-10收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of blocking chloride ion channel on growth of xenograft tumor,cell apoptosis and expressions of Oct4 and CD133 in Hep-2 xenograft tumor of nude mice

YUWenfa1)，ZHAOYulin2)，WANGPing3)，LUBaocai1)，MAHuimin1)，WANGHuimin1)

1)DepartmentofOtolaryngology,theFirstAffiliatedHospital，XinxiangMedicalCollege,Weihui453100

2)DepartmentofOtolaryngology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

3)DepartmentofFunctionalExamination,theThirdAffiliatedHospital，XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003

laryngeal neoplasm;chloride ion channel;Oct4;CD133;nude mouse;Hep-2

Aim: To study the effects of blocking chloride ion channel on human laryngeal carcinoma xenograft tumor in nude mice and its possible mechanism. Methods: Hep-2 cells were seeded subcutaneously into the nude mice to establish human laryngeal carcinoma xenograft tumor model and treated with NPPB at different concentrations(0,10,50,100 and 150 μmol/L), respectively for 4 weeks. The volume changes of the xenograft tumors were studied. TUNEL staining was used to determine cell apoptosis in xenograft tumor tissue. Immunohistochemistry staining was used to detect the expressions of Oct4 and CD133. Results: The volume of the tumors, apoptosis index, and the positive expression rates of Oct4 and CD133 in the 5 groups had significant differences(F=7.361,126.385，P<0.05); compared with 0 μmol/L NPPB group,the volume of the tumors decreased, the apoptosis index increased, and the positive expression rates of Oct4 and CD133 decreased in 50,100,and 150 μmol/L NPPB groups(P<0.05 or 0.005).Conclusion: Blocking the chloride ion channel may inhibit the growth of xenograft tumor, induce apoptosis of Hep-2 cells in the xenograft tumors through down-regulating the expressions of Oct4 and CD133.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.005

*河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新人才工程 2010141；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃 2010GGJS-120

R739.65