ClC-3在SIN-1誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用*

金小小，張淑玲，徐黎娟，范洪領，鐘志超，李 曦，常全忠#

1)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)生理學教研室 珠海 519041 2)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)兒科學教研室 珠海 519041 3)莆田市第一醫(yī)院檢驗科 莆田 351100

ClC-3在SIN-1誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用*

金小小1)，張淑玲2)，徐黎娟3)，范洪領1)，鐘志超1)，李 曦1)，常全忠1)#

1)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)生理學教研室 珠海 519041 2)遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)兒科學教研室 珠海 519041 3)莆田市第一醫(yī)院檢驗科 莆田 351100

#通訊作者，男，1965年5月生，博士，教授，研究方向：缺血性腦損傷及其保護機制，E-mail：cqzchang@sina.com

ClC-3氯通道；3-嗎啡斯得酮胺；海馬神經元；細胞凋亡；4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸

目的：探討ClC-3氯通道在NO供體SIN-1誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用。方法取離體培養(yǎng)12 d的SD大鼠海馬神經元，分為對照組、SIN-1組和SIN-1+DIDS組。對照組不作處理，SIN-1組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1作用18 h,SIN-1+DIDS組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1和0.1 mmol/L DIDS作用18 h。采用細胞免疫熒光染色和免疫印跡技術檢測各組ClC-3氯通道蛋白的表達，實時定量PCR技術檢測各組ClC-3氯通道 mRNA的表達。結果各組Caspase-3和ClC-3氯通道表達的差異有統(tǒng)計學意義(蛋白：FCaspase-3=118.330，P<0.001；FClC-3氯通道=102.750，P<0.001;mRNA:FClC-3氯通道=32.955，P<0.001)。SIN-1誘導凋亡神經元ClC-3氯通道蛋白表達增強，氯通道阻斷劑DIDS削弱ClC-3氯通道的表達。結論ClC-3氯通道可能參與SIN-1誘導大鼠海馬神經元的凋亡。

腦卒中是常見的腦血管疾病，缺血性腦損傷引起者多見，而神經元的凋亡直接影響到缺血性腦損傷的預后[1]。目前，缺血性腦損傷神經元凋亡的機制尚未闡明。近年來氯通道在缺血性腦損傷中的作用成為關注的熱點[2-3]。研究[4]顯示, 氯通道的激活所引起的心肌細胞容積減少在細胞凋亡過程中起關鍵作用，推測這種氯通道可能是ClC-3。作者[5]前期的研究結果提示ClC-3在缺血性腦損傷海馬神經元凋亡中可能有一定的作用。該研究利用NO供體3-嗎啡斯得酮胺(SIN-1)誘導離體大鼠海馬神經元損傷,通過細胞免疫熒光染色、Western blot和實時定量熒光PCR技術檢測ClC-3在神經元損傷過程中表達的變化,探討ClC-3活動與缺氧敏感性神經元凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑新生1 d的SD大鼠，由遵義醫(yī)學院實驗動物中心提供；DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)基、B27(美國Gibco公司產品)；SIN-1、氯通道阻斷劑4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸(DIDS)、ClC-3蛋白抗體、多聚賴氨酸、阿糖胞苷、DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)液等試劑購自美國Sigma公司；胎牛血清(杭州四季青公司產品)。

1.2離體海馬神經元的培養(yǎng)參照文獻[5-6]方法，取出生1 d的SD大鼠，雌雄不拘，無菌斷頭取腦，分離雙側海馬并將其剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，加入DMEM/F12培養(yǎng)液并吹打均勻，200目篩網過濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含有體積分數(shù)10%胎牛血清、0.2 mol/L谷氨酰胺和1 U/mL青、鏈霉素)，吹打混勻后接種在培養(yǎng)板內，置于含有體積分數(shù)95%空氣和5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后更換為Neurobasal培養(yǎng)液，加入1×10-5mol/L阿糖胞苷作用48 h。每周更換培養(yǎng)基2次，每次更換原液體的1/3。

1.3實驗分組及處理取培養(yǎng)12 d的神經元加入24孔板，隨機分為對照組、SIN-1組和SIN-1+DIDS組。對照組常規(guī)培養(yǎng)，SIN-1組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1作用18 h,SIN-1+DIDS組加入終濃度為0.5 mmol/L SIN-1和0.1 mmol/L DIDS作用18 h。每組設6個復孔。

1.4ClC-3蛋白的免疫熒光染色檢測取各組細胞，0.1 mol/L PBS漂洗，40 g/L多聚甲醛固定30 min， 0.1 mol/L PBS漂洗，正常山羊血清封閉1 h，加入ClC-3抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS 漂洗后多聚甲醛固定15 min，經0.1 mol/L PBS 漂洗，山羊血清封閉1 h，NeuN抗體(稀釋1 000倍)，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS漂洗，多聚甲醛固定30 min，加入二抗羊抗兔IgG(稀釋2 000倍)、羊抗小鼠IgG(稀釋2 000倍)作用1 h，0.1 mol/L PBS漂洗，多聚甲醛固定15 min， PBS漂洗后倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5ClC-3和Caspase-3蛋白的Westernblot檢測

取各組細胞，用冰冷0.1 mol/L PBS洗滌后每孔加200 μL細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BAC法測定蛋白含量并調節(jié)蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，SDS-PAGE電泳，NC膜轉移，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗Caspase-3多克隆抗體或ClC-3抗體(400倍稀釋)，4 ℃過夜，TBST緩沖液漂洗后加入HRP標記的二抗(2 000倍稀釋) 37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液漂洗5×5 min，ECL顯影。以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.6ClC-3mRNA表達的實時定量熒光PCR檢測ClC-3上游引物:5’-CTACTACCACCACGACTG-3’，下游引物:5’ -TTGTCACACCACCTAAGC-3’，擴增片段大小116 bp；GAPDH上游引物:5’-CTCCCATT CCTCCACCTTTG-3’，下游引物:5’-CCACCACCCTGT TGCTGTAG-3’，擴增片段大小110 bp。參照文獻[7]提取各組神經元總RNA，用1.0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后進行RNA反轉錄，染料法(SYBR Green I) 進行相對定量分析。反應條件：93 ℃預變性2 min，93 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR反應結束后，進行融解曲線分析。利用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System圖像分析系統(tǒng)，采用2-ΔΔCt進行相對定量分析，以GAPDH作為內參基因。實驗重復6次。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0分析，采用單因素方差和SNK-q檢驗分析比較各組Caspase-3和ClC-3的表達，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1ClC-3蛋白的免疫熒光染色結果SIN-1誘導海馬凋亡神經元ClC-3蛋白表達增強，氯通道阻斷劑DIDS削弱了ClC-3蛋白的表達(圖1)。

圖1 各組ClC-3蛋白的免疫熒光染色結果(×400)

2.2各組Caspase-3和ClC-3蛋白表達的Westernblot結果見圖2和表1。

2.3ClC-3mRNA表達的檢測結果見表1。

圖2 各組Caspase-3(上)和ClC-3(下)蛋白的Western blot 結果

表1 各組Caspase-3和ClC-3表達的比較

*:與對照組比較，P<0.001;#：與SIN-1 組比較，P<0.001。

3 討論

ClC-3為ClC型氯通道的家族成員之一,相對分子質量為84 000，廣泛表達于各種細胞，在大鼠的海馬、嗅球和小腦神經細胞上大量表達，參與細胞的多種生理功能[8-9]。氯通道在細胞凋亡中的重要作用逐漸引起重視。有學者[10]認為氯通道可能參與STS誘導的離體小鼠心肌細胞缺血性凋亡。氯通道阻斷劑NPPB可通過抑制H2O2激活的氯電流，阻滯細胞凋亡容積減少，從而防止PC12細胞發(fā)生凋亡。氯通道也參與了腫瘤細胞的凋亡[11]。

NO的過量產生是缺血性腦損傷后神經元凋亡的機制之一，而生理濃度的NO不會損傷神經元[12-13]。作者模擬缺血性腦損傷神經元凋亡的機制，選用NO供體誘導離體神經元損傷。SIN-1是一種常用的誘導神經元凋亡的NO供體，在水溶液中能產生大量的NO，后者可與O2結合生成自由基。根據(jù)文獻[14]，作者選擇0.5 mmol/L SIN-1用于離體海馬神經元凋亡的誘導。SIN-1 誘導神經元損傷后ClC-3蛋白和mR NA表達水平增強，而氯通道阻滯劑DIDS能削弱SIN-1誘導的ClC-3的表達。該研究結果提示ClC-3的活動與離體海馬神經元凋亡之間有一定關系，ClC-3可能參與了SIN-1誘導的海馬神經元凋亡。

ClC-3活動增強引起神經元凋亡的機制尚不清楚。資料[3,15]顯示，ClC-3 氯通道具有外向整流特性并具有容積敏感性，氯通道阻斷劑SITS和DIDS在阻斷細胞容積減少中起重要作用，結合該實驗結果推測：缺血性腦損傷后，ClC-3氯通道表達增強，Cl-伴隨K+的流出的同時也攜帶了細胞內水分大量外流，細胞容積減少進而誘發(fā)神經元的凋亡。ClC-3氯通道參與細胞凋亡的具體途徑有待進一步研究。

[1]方向華，王淳秀，梅利平，等.腦卒中流行病學研究進展[J].中華流行病學雜志，2011,32(9):847

[2]常全忠，張淑玲，尹金寶，等.氯通道阻斷劑對NO誘導離體大鼠海馬神經元凋亡的保護作用[J].中國藥理學通報,2009,25(9):1197

[3]鐘志超,范洪領,尹金寶，等,氯通道電流在離體大鼠海馬缺血缺氧性神經元凋亡中的變化及SITS的拮抗作用[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2011,46(3):367

[4]Takahashi N, Wang X, Tanabe S, et al. CIC-3-independent sensitivity of apoptosis to CI channel blockers in mouse cardiomyocytes[J].Cell Physiol Biochem,2005,15(6):263

[5]常全忠,張淑玲,尹金寶.電壓依賴性氯通道在3-嗎啉斯德酮亞胺誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2010, 24(1): 8

[6]Gomes JR,Costa JT,Melo CV,et al.Excitotoxicity downregulates TrkB.FL signaling and upregulates the neuroprotective truncated TrkB receptors in cultured hippocampal and striatal neurons[J].J Neurosci,2012,32(13):4610

[7]Wong YW, Sia GM, Too HP. Quantification of mouse glial cell-line derived neurotrophic factor family receptor alpha 2 alternatively spliced isoforms by real time detection PCR using SYBR Green I[J]. Neurosci Lett,2002, 320 (3): 141

[8]郭曉強.ClC型氯離子通道[J].生理學進展,2005,36(1):58

[9]Hara-Chikuma M,Yang B,Sonawane ND,et al.CIC-3 chloride channels facilitate endosomal acification and chloride accumulation[J]．J Biol Chem,2005,280(2)：1241

[10]Machado I,Cruz J,Lavernia J,et al.Superficial EWSR1-negative undifferentiated small round cell sarcoma with CIC/DUX4 gene fusion:a new variant of Ewing-like tumors with locoregional lymph node metastasis[J].Virchows Arch,2013,463(6):837

[11]柏志全,李春英,李緣,等.氯通道在華蟾酥毒基誘導的鼻咽癌細胞凋亡中起重要作用[J].中國病理生理雜志,2011, 27(5):833

[12]Li C, Feng JJ, Wu YP, et al. Cerebral ischemia-reperfusion induces GAPDH S-nitrosylation and nuclear ranslocation[J]. Biochemistry (Mosc),2012,77(6):671

[13]李曦，尹金寶，鐘志超，等.DIDS對SIN-1誘導大鼠海馬神經元凋亡及PARP-1/AIF表達的影響[J].中國藥理學通報,2012,28(11):1540

[14]Wei L,Xiao A Y,Jin C,et al.Effects of chloride and potassium channel blockers on apoptotic cell shrinkage and apoptosis in cortical neurons[J].Pflugers Arch,2004,448(3):325

[15]Yurinskaya VE, Moshkov AV, Wibberley AV, et al. Dual response of human leukemia U937 cells to hypertonic shrinkage: initial regulatory volume increase(RVI) and delayed apoptotic volume decrease(AVD)[J]. Cell Physiol Biochem,2012,30(4):964

(2013-06-05收稿 責任編輯李沛寰)

Effect of ClC-3 on hippocampal neuronal apoptosis of rats induced by SIN-1

JINXiaoxiao1),ZHANGShuling2),XULijuan3),FANHongling1),ZHONGZhichao1),LIXi1),CHANGQuanzhong1)

1)DepartmentofPhysiology，ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041 2)DepartmentofPediatrics,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041 3)DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstHospitalofPutianCity，Putian351100

ClC-3 chloride channel;SIN-1;hippocampal neuron;cell apoptosis;DIDS

Aim: To explore the expression of ClC-3 in the hippocampal neuronal apoptosis of rats induced by SIN-1. Methods: The hippocampal neurons from SD rats cultured for 12 days were randomly allocated into control group,SIN-1 group and SIN-1+DIDS group. The neurons in control group were not treated;the neurons in SIN-1 group were treated with 0.5 mmol/L SIN-1 for 18 h,and the neurons in SIN-1+DIDS group were treated with 0.5 mmol/L SIN-1 and 0.1 mmol/L DIDS for 18 h.Immunofluorescent staining, Western blot and PCR method were used to detect the expression of ClC-3 chloride. Results: The expressions of ClC-3 and Caspase-3 were different among the 3 groups(protein:FCaspase-3=118.330,P<0.001;FClC-3=102.750,P<0.001;mRNA：FClC-3=32.955,P<0.001). The expression of ClC-3 was enhanced after the SIN-1 induce neuronal apoptosis. Chloride channel blocker DIDS could significantly weaken the expression of ClC-3 inducing by SIN-1.Conclusion: ClC-3 may participate in the hippocampal neuron apoptosis induced by SIN-1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.006

*國家自然科學基金資助項目 81160157；貴州省優(yōu)秀科技人才省長基金 201209

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