肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達*

馮悅靜,魏小玲,尤愛國,周安燕,吳擁軍,王 威,何其棟,王 靜#

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001 3)河南省疾病預防控制中心傳染病預防控制所 鄭州 450016

肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達*

馮悅靜1),魏小玲2),尤愛國3),周安燕1),吳擁軍2),王 威2),何其棟2),王 靜1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001 3)河南省疾病預防控制中心傳染病預防控制所 鄭州 450016

#通訊作者，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的發病機制和早期預警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺,腫瘤；DNA甲基化轉移酶；組蛋白去乙酰化酶1

目的：研究肺癌患者血清中DNA甲基化轉移酶(DNMT)1、DNMT3a、DNMT3b和組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白的表達情況。方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法測定136例肺癌患者、140例肺良性疾病及145例健康體檢者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達，并分析DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達與肺癌臨床病理特征的關系。結果3組血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達差異有統計學意義(F=3.281、62.510、37.273、57.721，P<0.05)，肺癌患者均高于正常對照及肺良性疾病患者；非條件logistic回歸分析提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達均可影響肺癌的發生發展(P<0.001)；肺癌患者血清中DNMT1、DNMT 3a、DNMT 3b和HDAC1蛋白表達無組織學類型特異性(P>0.05)，但不同臨床分期其蛋白表達差異有統計學意義(t=0.843、0.244、0.222、0.878，P<0.05)。結論肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的高表達可能在肺癌的發生發展中發揮一定的作用。

表觀遺傳學是近年來研究肺癌發生的熱點，包括基因組DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA調控(miRNA)等。DNA甲基化是通過DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成的[1]。組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)是Taunton等[2]發現的第一個哺乳動物的組蛋白去乙酰化酶，它是多種蛋白質復合物的催化亞單位，參與組蛋白乙酰化水平的調控。兩者異常導致的基因組穩定性下降、抑癌基因功能喪失、原癌基因活性增高在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。新近研究[3-5]發現DNMT及HDAC1抑制劑在腫瘤治療中療效顯著，提示DNMT及HDAC1蛋白表達在腫瘤研究中有重要價值。既往研究多集中于肺癌組織中HDAC1和DNMTs蛋白表達。該研究通過ELISA方法檢測DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌、肺良性疾病患者及正常人血清中的表達，探討其可能的臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象136例肺癌患者來自鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科，其中男70例，女66例，年齡36～74(60.6±9.6)歲；吸煙者74例，不吸煙者62例；組織學類型：鱗癌53例，腺癌35例，其他48例。TNM分期(2009年肺癌國際分期修訂版)：Ⅰ期21例，Ⅱ期80例，Ⅲ期23例，Ⅳ期12例；患者均未接受放、化療和免疫治療。全部患者均經病理學確診。140例肺良性病變患者來自鄭州市第六人民醫院肺科,其中男71例，女69例，年齡29～76(56.8±18.8)歲；吸煙者77例，不吸煙者63例；肺結核69例，慢性支氣管炎12例，肺部感染26例，支氣管擴張23例，支氣管哮喘 10例。145例正常對照者為同期鄭州市第六人民醫院體檢科體檢的健康人，其中男75 例，女70例，年齡31～71(57.7±19.1)歲；吸煙者79名，不吸煙者66名。該研究經鄭州大學第一附屬醫院和鄭州市第六人民醫院臨床倫理委員會批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2標本收集所有研究對象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于干燥管內，37 ℃水浴30 min，然后3 000 r/min、4 ℃下離心3 min，取血清于EP管中，-80 ℃冰箱凍存備測。

1.3血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達的檢測采用ELISA法進行檢測。Wellscan MK3酶標儀、Wellwash MK2洗板機(美國Thermo公司)；96孔可拆式酶標板(浙江省臨海市化為分析器有限公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；DHP-600型電熱恒溫培養箱(北京市光明醫療儀器廠)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1 ELISA試劑盒(北京鼎國生物研究有限公司)。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統計學處理應用SPSS 12.0進行分析。收集受試者吸煙史等，其中吸煙定義為每天吸煙≥1支，持續半年以上[6]。3組受試者血清和不同臨床病理特征肺癌患者DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；采用非條件logistic回歸分析血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達與肺癌危險性的關系。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組受試者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白的表達水平見表1。

表1 3組受試者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表達水平 μg/L

*:與正常對照組比較，P<0.05；#：與肺良性病變組比較，P<0.05。

2.2肺癌的影響因素分析相關變量的賦值見表2(蛋白按對照組的中位數為分界點)。年齡、性別、吸煙史及血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1水平高均是肺癌發生發展的影響因素，見表3。

表2 變量與賦值

表3 肺癌影響因素的非條件logistic回歸分析結果

2.3不同臨床病理特征肺癌患者血清HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達的比較見表4。

表4 不同臨床病理特征肺癌患者HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達的比較 μg/L

3 討論

在哺乳動物體內，DNA甲基化是通過DNMT催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶核苷酸的嘧啶環第5位碳原子甲基化，形成CpG島[1]。目前發現DNMT家族，尤其是DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在DNA初始甲基化及甲基化維持中發揮重要作用[7-9]，其活性的異常參與了腫瘤的發生發展過程，是導致抑癌基因發生甲基化的重要因素。Lin等[10]研究已證實在腫瘤組織中抑癌基因啟動子區高甲基化與DNMT蛋白表達水平密切相關，在多種腫瘤中都明顯升高，尤其在有吸煙史肺癌患者中，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達顯著增高，并且DNMT1蛋白高表達的患者預后不良。Kim等[11]對102例非小細胞肺癌進行研究，結果發現DNMT1和DNMT3b mRNA表達提高，同時檢出相關抑癌基因高甲基化。與異常甲基化類似，組蛋白修飾在基因表達的調節中同樣扮演重要角色。組蛋白乙酰化的失衡將引起相應的染色體結構和基因轉錄水平的改變，并影響細胞周期、細胞分化及凋亡，進而導致腫瘤的發生。HDAC1使組蛋白去乙酰化，與DNA緊密結合，染色質呈致密卷曲的阻抑結構，從而抑制基因轉錄，參與腫瘤的發生發展[2]。Sasaki等[12]在102例NSCLC標本中，發現Ⅲ期和Ⅳ期患者的HDAC1蛋白的表達明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，而在腫瘤和鄰近非腫瘤組織中的表達無明顯差別。

該研究結果顯示肺癌組血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表達均高于正常人及肺良性疾病患者。與劉啟明[13]的研究結果相一致，提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌的發生中可能起重要作用。

該研究非條件logistic回歸分析結果提示，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達均是肺癌的影響因素，這與DNMT1在其他惡性腫瘤如肝癌、肺腺癌、腎癌[14]、卵巢癌[15]中表達的研究結果相一致。

另外，該研究還分析了DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌不同組織學類型及分期中的表達，結果顯示不同組織學類型的肺癌DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達無顯著差異。Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表達水平明顯高于Ⅲ、Ⅳ期。與孫云暉等[16]的報道一致。提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表達可能是肺癌發生發展過程中的重要分子事件。

總之，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在腫瘤發生發展的具體機制究竟如何，尚需進一步的研究。

[1]Luczak MW,Jagodzinski PP.The role of DNA methylation in cancer development[J].Folia Histochem Cytobiol,2006,44(3):143

[2]Taunton J,Hassig CA,Schreiber SL.A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p[J].Science,1996,272(5260):408

[3]Takayama K,Shimoda N,Takanaga S,et al.Expression patterns of dnmt3aa, dnmt3ab, and dnmt4 during development and fin regeneration in zebrafish[J].Gene Expr Patterns,2014,14(2):105

[4]Cacan E,Ali MW,Boyd NH,et al.Inhibition of HDAC1 and DNMT1 modulate RGS10 expression and decrease ova rian cancer chemoresistance[J].PLoS One，2014，9(1):e87455

[5]莊涵虛,馬旭東,賴亞棟,等.DNA干擾沉默HDAC1基因對胃癌細胞增殖、凋亡、組蛋白乙酰化和甲基化的影響[J].南方醫科大學學報,2014,34(2):246

[6]Steliga MA,Dresler CM.Epidemiology of lung cancer:smoking,secondhand smoke,and genetics[J].Surg Oncol Clin N Am,2011,20(4):605

[7]Robert MF,Morin S,Beaulieu N,et al.DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cell[J].Nat Genet,2003,33(1):61

[8]Robertson KD.DNA methylation,methyltransferases,and cancer[J].Oncogene,2001,20(24):3139

[9]徐岷,高軍,高道鍵,等.DNMT1 siRNA對人胰腺癌PaTu8988細胞周期的調控機制研究[J].解放軍醫學雜志,2009,34(1):21

[10]Lin RK,Hsu HS,Chang JW,et al.Alteration of DNA methyltransferases contributes to 5'CpG methylation and poor prognosis in lung cancer[J].Lung Cancer,2007,55(2):205

[11]Kim H,Kwon YM,Kim JS,et al.Elevated mRNA levels of DNA methyltransferase-1 as an independent prognostic factor in primary nonsmall cell lung cancer[J].Cancer,2006,107(5):1042

[12]Sasaki H,Moriyama S,Nakashimay,et al.Histone deacetylase 1 mRNA expression in lung cancer [J]. Lung Cancer,2004,46(2):171

[13]劉啟明. DNA 甲基化轉移酶1 在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].實用臨床醫藥雜志，2011，15(23)：11

[14]Milutinovic S, Zhuang Q, Niveleau A, et al. Epigenomic stress response.Knockdown of DNA methyltransferase 1 triggers and intra-S-phase arrest of DNA replication and induction of stress response genes[J].J Biol Chem, 2003, 278(17):14985

[15]Zambrano P, Segura-Pacheco B, Perez-Cardenas E, et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes[J].BMC Cancer, 2005, 5: 44

[16]孫云暉，陳麗，閻紅娥，等. HDAC1和DNMT1在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].黑龍江醫藥科學，2010,33(6)：77

(2013-08-07收稿 責任編輯李沛寰)

Expressions of DNMT1,DNMT3a,DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer

FENGYuejing1),WEIXiaoling2),YOUAiguo3),ZHOUAnyan1),WUYongjun2),WANGWei2),HEQidong2),WANGJing1)

1)DepartmentofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

3)InstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

lung，neoplasm;DNA methyltransferase;histone deacetylases 1

Aim: To study the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer. Methods: ELISA was used to measure the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in the serum from 136 lung cancer patients,140 cases of lung benign diseases and 145 healthy people (control group), and the relationship between the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, HDAC1 and clinical characteristics of lung cancer was analyzed. Results:The expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in patients with lung cancer were higher than those in lung benign diseases group and control group(F=3.281，62.510，37.273，57.721，P<0.05). The result of logistic regression showed that the overexpressions of DNMT1, DNMT3a，DNMT3b and HDAC1 might increase the risk of lung cancer (P<0.001). There were no correlations among the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b or HDAC1 between different histological types (P>0.05)，while there were statistical significances in the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 between different stages (t=0.843，0.244，0.222，0.878，P<0.05).Conclusion: The overexpressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 could contribute to the occurrence and development of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.008

*國家自然科學基金資助項目 30972457；河南省重大科技攻關項目 112102310102

R734.2