LRIG3反義寡核苷酸對宮頸癌Hela229細胞LRIG3、EGFR表達及增殖的影響

郭歷琛，史惠蓉，盛浴瀾，張平安，張 銳

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)上海市嘉定區中心醫院婦產科 上海 201800

LRIG3反義寡核苷酸對宮頸癌Hela229細胞LRIG3、EGFR表達及增殖的影響

郭歷琛1,2)，史惠蓉1)#，盛浴瀾2)，張平安2)，張 銳2)

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)上海市嘉定區中心醫院婦產科 上海 201800

#通訊作者，女，1959年12月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail:Hrshi2011@163.com

LRIG3；反義寡核苷酸；EGFR；增殖；宮頸癌

目的：探討LRIG3反義寡核苷酸(ASODN)對宮頸鱗癌Hela229細胞LRIG3、EGFR表達及增殖的影響。方法利用陽離子脂質體介導法分別用150、200及250 mg/L的LRIG3 ASODN、正義寡核苷酸(SODN)及無關序列核苷酸(MSODN)轉染Hela229細胞24、48及72 h，分別應用RT-PCR和Western blot法檢測細胞LRIG3、EGFR mRNA及蛋白的表達情況，應用MTT法檢測細胞增殖率。 以常規培養的細胞作空白對照。結果轉染24、48、72 h后，ASODN組細胞增殖率均較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達增高(P<0.05)；3個ASODN劑量組間比較，隨著LRIG3 ASODN劑量的增加，細胞增殖率增高(P<0.05)，LRIG3 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。結論LRIG3 ASODN可促進宮頸鱗癌Hela229細胞的增殖，該效應可能與抑制LRIG3表達、促進EGFR表達有關。

在全球范圍內，宮頸癌發病率僅次于乳癌，且出現患者年輕化的趨勢，傳統的手術治療和放化療有著很大的局限性，特別是對于局部晚期宮頸癌患者治療效果不甚令人滿意。隨著分子生物學和免疫學技術的發展，從基因層面治療宮頸癌已逐漸成為新的研究方向。分子靶向治療具有副作用小、專一性高等優點，其中反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASODN)技術有著靶向性強、可控、易操作等優點。具有亮氨酸重復序列免疫球蛋白樣結構域(the leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains，LRIG)是一組最近發現的轉膜蛋白，被稱為LRIG基因家族，該家族共有3個成員，即LRIG1、LRIG2和LRIG3[1-4]。LRIG1是最先發現的家族成員，最近的研究[5]證實LRIG1可以抑制腫瘤的惡化和增生。LRIG3與LRIG1的組成結構較為相似，可能有著與LRIG1相似的功能[6]。作者觀察了利用ASODN技術抑制LRIG3表達對宮頸鱗癌Hela229細胞增殖的影響，為宮頸鱗癌的靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑Hela229細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，細胞用含體積分數10%胎牛血清(美國Gibco公司)的RPMI 1640完全培養基在37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。Trizol為MRC公司產品，MTT、DAB顯色劑為美國Sigma公司產品，Taq酶、逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司，鼠抗人LRIG3單克隆抗體、兔抗人LRIG3多克隆抗體、兔抗人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)多克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2LRIG3反義寡核苷酸的合成應用RNA structure3.5對LRIG3的二級結構進行模擬，針對LRIG3 mRNA設計一條ASODN、一條正義寡核苷酸(SODN)、一條無關序列(MSODN)。3條序列皆進行硫代修飾，由上海生工生物技術服務有限公司合成，-20 ℃保存備用。LRIG3 ASODN序列：5’-GGT CTCCAATTCATTGTTGT-3’；LRIG3 SODN序列： 5’-ACAACAAUGAAUUGGAGACC-3’；LRIG3 MSODN序列：5’-TTAGCTTTGCTGGATGTCAG-3’。

1.3實驗分組利用陽離子脂質體介導法分別將150、200、250 mg/L的LRIG3 ASODN、SODN和MSODN體外轉染Hela229細胞24、48和72 h，然后進行LRIG3、EGFR mRNA和蛋白表達的檢測，同時檢測細胞增殖率。設常規培養的細胞作空白對照。

1.4細胞增殖率的測定收集各組對數生長期的細胞，經過胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，經細胞計數后接種在96孔板，每孔細胞數103～104，每組3個復孔。待細胞鋪滿孔底，采用MTT 法檢測細胞增殖率。酶標儀檢測波長為492 nm。細胞增殖率=(A實驗組-A0)/A0，A0為實驗開始時實驗組的A值。

1.5LRIG3和EGFRmRNA的檢測根據PubMed檢索設計合成LRIG3、EGFR以及內參GAPDH引物序列，由上海生工生物技術服務有限公司合成。LRIG3引物序列：正義鏈 5’-CACATCAATG GAACCTGGGTATTTTGAC-3’，反義鏈5’-GTTTCGGT TCAATTCGAGATGTTGCAGTT-3’，產物長度139 bp。EGFR 引物序列：正義鏈5’-TCCCTCAGCCAC CCATATGTAC-3’，反義鏈5’-GTCTCGGGCCATTTTG GAGAATCC-3’，產物長度125 bp。GAPDH引物序列：正義鏈5’-ACCACAGTCCATGAAATCAC-3’，反義鏈5’-AGGTTTCTCCAGGCGGCATG-3’，產物長度230 bp。用TRN-zol-A+RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA，用 M-MLV 逆轉錄酶進行逆轉錄，取逆轉錄產物進行PCR。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，33個循環；最后72 ℃延伸7 min。產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用Gel-Doc2000 型凝膠成像分析系統進行分析，以目的條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.6LRIG3和EGFR蛋白的檢測采用Western blot法。用PMSF細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白，測定蛋白濃度，用100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠進行蛋白電泳，將蛋白轉移到PVDF膜中，用含有50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加一抗4 ℃過夜，用TPST洗膜3次，后加HRP標記的二抗孵育1 h，用TBST洗膜3次，DAB 顯色，用圖像分析系統檢測條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 13.0進行統計分析。各組LRIG3、EGFR蛋白及mRNA表達水平及細胞增殖率的比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞增殖率的變化見表1～3。轉染LRIG3 ASODN后，細胞增殖率較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯增高。轉染24、48、72 h后,3個ASODN劑量組間細胞增殖率差異有統計學意義(F=19.253、51.598、29.328,P=0.003、<0.001、<0.001),隨著ASODN劑量的增加，細胞增殖率亦增高(P<0.05)。

表1 150mg/LLRIG3SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞增殖率的影響

組別n24h48h72h空白對照組30．645±0．0570．670±0．0500．673±0．085SODN組30．655±0．0970．709±0．0700．824±0．090MSODN組30．607±0．0760．705±0．0640．839±0．113ASODN組30．893±0．119?3．015±0．286?4．895±0．527?F5．8884．31515．837P0．0200．0440．001

*:與其他3組比較，P<0.05。

表2 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞增殖率的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表3 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞增殖率的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

2.2各組細胞中LRIG3和EGFRmRNA的表達

見圖1及表4～6。ASODN組細胞中LRIG3 mRNA表達較其他3組明顯下降，EGFR mRNA表達增高。轉染24、48、72 h,3個ASODN劑量組間LRIG3和EGFR mRNA表達水平差異有統計學意義(F=17.043和9.974、47.514和15.066、85.374和11.650,P均<0.05),隨著ASODN劑量的增加，LRIG3 mRNA表達水平降低(P<0.05)，EGFR mRNA表達水平升高(P<0.05)。

圖1 轉染24 h細胞中LRIG3(上)和EGFR(下) mRNA的表達

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN組；4：150 mg/L SODN組；5：150 mg/L MSODN組；6：空白對照組。

表4 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR mRNA表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表5 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR mRNA表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表6 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR mRNA表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

2.3各組細胞中LRIG3和EGFR蛋白的表達見圖2及表7～9。ASODN組細胞中LRIG3蛋白表達較空白對照組、SODN組、MSODN組明顯下降，EGFR蛋白表達增高。轉染24、48、72 h,3個ASODN劑量組間LRIG3和EGFR蛋白表達水平差異有統計學意義(F=12.325和4.287、25.185和10.941、16.046和9.951,P均<0.05),ASODN劑量越大，LRIG3蛋白表達水平越低(P<0.05)，EGFR蛋白表達水平越高(P<0.05)。

圖2 轉染48 h 細胞中LRIG3和EGFR蛋白的表達

M：Marker；1～3：150、200、250 mg/L ASODN組；4：150 mg/L SODN組；5：150 mg/L MSODN組；6：空白對照組。

表7 150 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR蛋白表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表8 200 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR蛋白表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

表9 250 mg/L LRIG3 SODN、MSODN及ASODN對Hela229細胞中LRIG3和EGFR蛋白表達的影響

*:與其他3組比較，P<0.05。

3 討論

研究顯示，LRIGs的異常表達和人類的許多疾病有一定的關系，在許多人類的腫瘤組織中都能檢測到LRIGs的異常表達，但在不同腫瘤中LRIGs的表達存在很大差異，在結腸癌細胞系、前列腺癌細胞系、透明細胞癌組織、肺癌細胞系、皮膚鱗癌患者切除組織等多種組織細胞內LRIG1 mRNA和蛋白表達均較正常組織下降[7-8]，而在白血病、星狀細胞瘤、前列腺癌中LRIG1的表達增高[9-10]。有關LRIG3與腫瘤的研究資料更為稀缺。

EGFR作為一種受體酪氨酸激酶，是Ⅰ型受體酪氨酸激酶超家族的成員，是原癌基因c-erbB1(HER-1)的表達產物，其在多數上皮來源性惡性腫瘤中過度表達，且表達水平與腫瘤的浸潤、轉移、惡性程度、預后、患者生存率密切相關[11]。EGFR蛋白的過表達能夠使腫瘤細胞處于長期活化狀態，從而導致細胞惡性增殖。

作者將LRIG3 ASODN轉染宮頸鱗癌Hela229細胞，采用RT-PCR和Western blot法檢測其LRIG3、EGFR mRNA和蛋白的表達。結果顯示，LRIG3 ASODN能夠顯著抑制細胞中LRIG3 mRNA和蛋白的表達，且該效應具有一定的劑量依賴性；隨著LRIG3表達的降低，細胞的增殖活性亦升高，細胞中EGFR mRNA和蛋白的表達也逐漸增強。提示LRIG3有可能通過調控EGFR的表達，從而抑制宮頸鱗癌細胞的增殖。

綜上所述，LRIG3或許能成為輔助宮頸鱗癌診斷新的參考指標，同時對LRIG3的表達水平進行干預，提高其表達水平，可能成為宮頸癌分子靶向治療的一個新的途徑。

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(2013-12-10收稿 責任編輯王 曼)

Effect of LRIG3-targeted antisense oligonucleotides on proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells

GUOLichen1,2),SHIHuirong1),SHENGYulan2),ZHANGPing’an2),ZHANGRui2)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGynecologyandObstetrics,CentralHospitalofShanghaiJiadingDistrict,Shanghai201800

LRIG3;antisense oligonucleotide;EGFR;proliferation;cervical carcinoma

Aim: To observe the proliferation and expressions of LRIG3 and EGFR in Hela229 cells transfected with LRIG3-targeted antisense oligonucleotide(ASODN).Methods:The ASODN, SODN and MSODN of LRIG3 at doses of 150, 200 and 250 mg/L were transfected into Hela229 cells by the cationic liposome respectively for 24, 48, and 72 h. RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of LRIG3 and EGFR,and MTT assay was used to examine the proliferation of Hela229 cells. The cells with normal incubation were the blank control. Results: Compared with the blank control group, SODN group and MSODN group, the proliferation rate of ASODN group was significantly higher(P<0.05), the expressions of LRIG3 mRNA and protein decreased(P<0.05), and the expressions of EGFR mRNA and protein increased with the increase of ASODN concentration(P<0.05).Conclusion: LRIG3 ASODN can promote the proliferation of Hela229 cells, which is related to inhibition of LRIG3 expression and promotion of EGFR expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.009

R737.33