阿霉素、5-氟尿嘧啶聯合熱療對SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響

張繼新，龐志剛，劉 超，劉新江，尚 闖，耿 翔

鄭州大學第二附屬醫院普外科 鄭州 450014

阿霉素、5-氟尿嘧啶聯合熱療對SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響

張繼新，龐志剛#，劉 超，劉新江，尚 闖，耿 翔

鄭州大學第二附屬醫院普外科 鄭州 450014

#通訊作者，男，1963年7月生，碩士，主任醫師，教授，研究方向：原發性肝癌，E-mail：pzg63726@sina.com

阿霉素；5-氟尿嘧啶；熱療；熱化療；SMMC-7721細胞；細胞增殖；細胞凋亡

目的：探討阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)聯合熱療對肝癌SMMC-7721細胞增殖和凋亡的影響。方法SMMC-7721細胞分為對照組、單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組、5-FU+ADM+熱療組，各組熱處理均為43 ℃水浴1 h再37 ℃培養23 h。各組處理24 h后采用MTT法檢測細胞的增殖，計算增殖抑制率，采用流式細胞術檢測細胞凋亡，計算凋亡率。結果5-FU+ADM+熱療組細胞增殖抑制率高于單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%、(55.04±1.89)%、(40.21±2.27)%、(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]。5-FU+ADM+熱療組的細胞凋亡率高于單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%、(65.40±2.05)%、(49.32±1.76)%、(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)]。結論加熱能增強5-FU聯合ADM化療對SMMC-7721細胞增殖的抑制和凋亡誘導作用，其效應優于單純熱療或ADM與5-FU聯合以及單純化療聯合熱療。

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。該病起病隱匿、發展較快，侵襲性強、復發率高、治療較難，目前尚缺乏有效的治療藥物，因此尋找安全有效的治療方法已成為目前研究的重點。腫瘤熱療有“綠色療法”之稱[1]。研究[2-3]已證實，熱療能顯著提高腫瘤對化療藥物的敏感性及化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，但現有研究僅限于單種化療藥物聯合熱療。已有文獻[4-5]報道化療藥物聯合熱療對肝癌細胞的殺傷作用明顯高于單獨化療。阿霉素(adriamycin,ADM)與5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床常用化療藥物。作者觀察了ADM與5-FU聯合化療再結合熱療對人肝癌SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響，為肝癌的臨床治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1材料SMMC-7721細胞株由河南省腫瘤醫院中心實驗室提供；注射用鹽酸ADM(輝瑞制藥有限公司產品)，5-FU(美國Sigma公司),四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司), 二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司), AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(聯科生物公司)。

1.2細胞培養和分組將SMMC-7721細胞置于配制好的含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液中，放入37 ℃、體積分數5%CO2、濕度80%培養箱中培養。每2 d換液1次，2～3 d傳代。實驗分組及處理方法：實驗設6組，每組6個復孔，獨立重復3次。取對數生長期的SMMC-7721細胞，經2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集細胞，調細胞密度至3×104mL-1，接種于96孔板中，每孔內加150 μL細胞懸液。①對照組：加入細胞懸液及50 μL培養液，不加任何藥物。空白對照僅加入培養液，用于機器調零。②單純熱療組：加50 μL培養液置于43 ℃恒溫培養箱中培養1 h，熱處理后繼續置入培養體系(37 ℃，下同)中培養23 h。③5-FU+ADM組：加入含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培養液共50 μL，于培養體系中培養24 h。④ADM+熱療組：加入50 μL含1 mg/L ADM的培養液，置于43 ℃恒溫培養箱中培養1 h后繼續置入培養體系中培養23 h。⑤5-FU+熱療組：加50 μL含0.25 g/L 5-FU的培養液，置于43 ℃恒溫培養箱中培養1 h后繼續置入培養體系中培養23 h。⑥5-FU+ADM+熱療組：加入50 μL含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培養液后，置于43 ℃恒溫培養箱中培養1 h后繼續置入培養體系中培養23 h。

1.3細胞增殖抑制率測定細胞按1.2中分組處理，各組最終容積為200 μL。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL繼續培養4 h后終止培養，棄上清液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min；檢測490 nm處各孔的吸光度(A)值，計算增殖抑制率。增殖抑制率=[(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值]×100%。采用協同作用q值[6]判斷化療與熱療聯合應用的性質。q=E(CD)/(EC+ED-EC×ED),式中E(CD)為ADM與5-FU聯合熱療的增殖抑制率, EC為單純熱療組的增殖抑制率，ED為ADM和5-FU聯合化療的增殖抑制率。q<0.85示兩者有拮抗作用，0.85≤q≤1.15示兩者有相加作用，q>1.15示兩者有協同作用。

1.4細胞凋亡檢測細胞按1.2中分組處理后，每組收集5×105個細胞，經胰蛋白酶消化后移入10 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入PBS液，1 000 r/min離心10 min，前后共離心、洗滌細胞2次；向洗滌后的細胞中加入1 mL Binding buffer，然后加入10 μL AnnexinV/FITC和5 μL PI。輕輕混勻，在室溫避光條件下反應15 min。應用流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算凋亡率。

1.5統計學處理應用SPSS 17.0處理數據。各組間細胞增殖抑制率和凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞增殖抑制率和凋亡率比較見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率與凋亡率比較(n=3) %

*:與5-FU+ADM+熱療組比較，P<0.01。

2.2協同作用熱療與ADM及5-FU聯合應用時在抑制SMMC-7721細胞增殖中的q值為1.17。

3 討論

熱療為一種新的腫瘤治療方法，被稱為繼手術、化療、放療和生物治療之后的第5種腫瘤治療模式[7]。人體正常細胞和癌細胞對熱的耐受性和敏感性存在明顯差異[8-9]。熱療對腫瘤細胞的殺傷作用取決于溫度和時間，藥物對癌細胞的殺傷作用具有時間依賴性。已證明[10]，42～43 ℃對腫瘤細胞的殺傷力最強。有研究[11]表明43 ℃藥物作用60 min時對胃癌細胞的殺傷作用已接近最大。也有研究[12]表明全身治療的恒溫期治療時間為1 h。Nikfarjam等[13]對肝癌細胞加熱后發現，其細胞凋亡可持續96 h，并在24 h達到高峰。結合臨床實際情況及患者的耐受性，該實驗以溫度43 ℃ 60 min后繼續培養23 h為熱療條件。

5-FU目前仍是肝癌化療的首選藥物，可阻滯G1期細胞向S期轉化的進程，而熱療與5-FU聯合應用既能抑制細胞周期G1的進程又能抑制S期細胞，從而使G2/M期細胞增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應[14]。ADM是腫瘤細胞有絲分裂S期非特異性阻滯藥物，主要作用機制是在DNA合成過程中誘導TOPOⅡ抑制劑-DNA斷裂物復合物的形成，引起細胞死亡或停滯于S期、G2期[15-16]。熱療與化療協同作用的機制在于：化療對富氧細胞的敏感性高于乏氧細胞，熱療對乏氧細胞的敏感性高于富氧細胞，因此化療配合熱療既可殺滅富氧細胞又能殺滅乏氧細胞；熱療可使細胞膜蛋白變性、細胞膜穩定性破壞、通透性升高、物質轉運障礙、呼吸抑制、酸中毒，從而使化療藥物進入細胞內的量增多，增加了細胞毒作用，加強了化療效果[17]；熱療還可增加血供，促進化療藥物局部積聚攝取和加快反應速度；熱化療共同促進癌細胞凋亡的發生[18]；熱化療可增加對癌細胞的殺傷，并降低癌細胞的多種藥物抗藥性[19]。

該實驗結果顯示，熱療聯合兩種化療藥物可以顯著提高人肝癌SMMC-7721細胞的增殖抑制率及凋亡率，且效果較單純熱療、兩種化療藥物聯合及單種化療藥物聯合熱療好。熱療和化療聯合有很好的互補性，但我國腫瘤熱療研究尚處于初級階段。如何把當前熱療方法與化療相結合，根據腫瘤細胞的種類及生物學特性選擇最合適的化療聯合方案、最佳的熱療溫度及時間以及熱療和化療應用的先后順序及間隔時間，仍是下一步研究的重點。

[1]Hiraoka M, Masunaga S, Nishimura Y, et al. Regional hyperthermia combined with radiotherapy in the treatment of lung cancers[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,22(5):1009

[2]何躍明,呂新生,艾中立,等.磁介導熱療聯合順鉑化療對肝癌細胞的影響及其機制[J].中華實驗外科雜志,2004,21(10):1170

[3]徐春燕,高姍,王琳,等.不同溫度熱療聯合紫杉醇化療對肺癌A549細胞增殖及Akt蛋白表達的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2008,43(3):524

[4]王倩榮,史正華,馬驥,等.阿霉素熱化療對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].現代腫瘤醫學,2011,19(10):1918

[5]劉賢英,徐茂鳳,金春香,等.5-氟尿嘧啶聯合熱療對人肝癌細胞株的增殖抑制作用[J].中國綜合臨床,2010,26(12):1233

[6]Gillies RJ,Gatenby RA.Hypoxia and adaptive landscapes in the evolution of carcinogenesis[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(2):311

[7]Raut CP,Evans DB,Crane CH,et al.Neoadjuvant therapy for respectable pancreatic cancer[J].Surg Oncol Clin N Am,2004,13(4):639

[8]Sakaguchi Y,Stephens LC,Makino M,et al.Apoptosis in tumors and normal tissues induced by whole body hyperthermia in rats[J].Cancer Res,1995,55(22):5459

[9]Hildebrandt B,Wust P,Ahlers O,et al.The cellular and molecular basis of hyperthermia[J].Crit Rev Oncol Hematol,2002,43(1):33

[10]張洪新,王執民,郭衛平,等.絲裂霉素C熱化療對人肝癌細胞-7721的細胞毒作用[J].第四軍醫大學學報,1998(6):636

[11]孫躍民,傅軍,張偉,等.溫熱化療對胃、結腸癌細胞的體外作用研究[J].癌癥,2006,25(8):974

[12]Westermann AM,Grosen EA,Katschinski DM,et al.A pilot study of whole body hyperthermia and carboplatin in platinum-resistant ovarian cancer[J].Eur J Cancer,2001,37(9):1111

[13]Nikfarjam M,Muralidharan V,Malcontenti-Wilson C,et al.The apoptotic response of liver and colorectal liver metastases to focal hyperthermic injury[J].Anticancer Res,2005,25(2B):1413

[14]Ellinger-Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,et al.Ste20-like kinase(SLK), a regulatory kinase for polo-like kinase(Plk) during the G2/M transition in somatic cells[J].Genes Cells,2000,5(6):491

[15]Sun X,Xing L,Ling CC,et al.The effect of mild temperature hyperthermia on tumor hypoxia and blood perfusion:relevance for radiotherapy,vascular targeting and imaging[J].Int J Hyperthermia,2010,26(3):224

[16]Kim YJ,Yoon SY,Kim JT,et al.NDRG2 suppresses cell proliferation through down-regulation of AP-1 activity in human colon carcinoma cells[J].Int J Cancer,2009,124(1):7

[17]劉寶瑞,錢曉萍.腫瘤熱化療的基礎與臨床研究進展[J].國外醫學:腫瘤學分冊,2004,31(1):34

[18]Burd R,Dziedzic TS,Xu Y,et al.Tumor cell apoptosis, lymphocyte recruitment and tumor vascular changes are induced by low temperature, long duration(fever-like) whole body hyperthermia[J].J Cell Physiol,1998,177(1):137

[19]Hsuen Lim E,Seng Cheong Lim R,Seng Wu T,et al.Oxaliplatin/fluorouracil/leucovorin in advanced colorectal carcinoma: an asian experience[J].Ann Pharmacother,2003,37(12):1909

(2013-10-20收稿 責任編輯徐春燕)

Effect of adriamycin and 5-fluorouracil combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells

ZHANGJixin,PANGZhigang,LIUChao,LIUXinjiang,SHANGChuang，GENGXiang

DepartmentofGeneralSurgery，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

adriamycin;5-fluorouracil;hyperthermia;thermo-chemotherapy;SMMC-7721 cell;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To study the effect of adriamycin(ADM) and 5-fluorouracil(5-FU) combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells. Methods: SMMC-7721 cells were allocated into 6 groups：control group，pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group, 5-FU+ADM+hyperthermia group. The cell proliferation inhibition effect was evaluated by MTT assay.The apoptosis of SMMC-7721 cells were determined by flow cytometry. Results: The cell proliferation inhibition rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%,(55.04±1.89)%,(40.21±2.27)%,(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]; the apoptosis rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%,(65.40±2.05)%,(49.32±1.76)%,(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)].Conclusion: ADM and 5-FU combined with hyperthermia can increase the inhibition effect on proliferation and induce apoptosis of SMMC-7721 cells compared with pure hyperthermia, or ADM and 5-FU combination or single chemotherapy combined with hyperthermia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.020

R735.7