急性髓系白血病患者骨髓WT1基因的表達與預后的關系

萬鼎銘,邊志磊,劉延方,曹偉杰,張 媛,李 濤,何海燕,玄中乾

1)鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052 2)新鄉醫學院第一附屬醫院血液科 新鄉 453100 3) 鄭州大學血液病研究所 鄭州 450052△男,1963年5月生,博士,教授,主任醫師,研究方向：血液病和造血干細胞移植的基礎和臨床，E-mail：wwddmm@vip.sina.com

急性髓系白血病患者骨髓WT1基因的表達與預后的關系

萬鼎銘1)△,邊志磊1),劉延方1),曹偉杰1),張 媛2),李 濤1,3),何海燕1),玄中乾1)

1)鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052 2)新鄉醫學院第一附屬醫院血液科 新鄉 453100 3) 鄭州大學血液病研究所 鄭州 450052△男,1963年5月生,博士,教授,主任醫師,研究方向：血液病和造血干細胞移植的基礎和臨床，E-mail：wwddmm@vip.sina.com

急性髓系白血病；WT1基因；預后

目的：探討急性髓系白血病(AML)患者骨髓WT1基因的表達與預后的關系。方法應用實時定量逆轉錄PCR方法檢測122例初診AML患者骨髓WT1基因的表達水平，并進行初次誘導化療緩解率(CR1)及2 a無白血病生存率(LFS)和總生存率(OS)的分析。對照組為21例非白血病患者或造血干細胞移植健康供者。結果對照組骨髓WT1基因表達水平為0.007(0.002，0.080)；AML組為0.677(0.336，0.763)，明顯高于對照組(Z=2.620，P<0.001)。AML-M3患者WT1基因高表達組與低表達組CR1、2 a LFS和OS無差異。AML(非M3)患者WT1基因低表達組CR1為82．6%(38/46)，高表達組為52.3%(23/44)，兩組比較，差異有統計學意義(χ2=9.476,P=0.002)；兩組的總生存曲線和無白血病生存曲線差異有統計學意義(χ2=5.410、4.698,P<0.05)，高表達組2 a OS(36.0%)和LFS(33.3%)均低于低表達組(57.7%和53.7%)。結論骨髓WT1基因表達水平是預測AML預后的有效監測指標。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類高度異質性疾病，不同亞型甚至同一亞型仍可能有不同的長期預后[1]。如何準確地作出預后分層，進而提供更加具有針對性和個體化的治療方案，從而提高整體長期生存率，是AML治療中最熱門也是最棘手的問題之一。實時定量逆轉錄PCR(RQ-RT-PCR)是應用熒光探針結合逆轉錄PCR方法動態監測封閉試管內mRNA水平變化，與流式細胞術相比，具有更高的敏感性和特異性。該方法用于特定融合基因或突變基因的檢測已相當成熟，廣泛應用于AML的預后分層及復發預測[2-3]。然而大部分AML患者并不存在特異的遺傳學或分子學標記，因此需要尋找新的泛白血病監測指標。WT1基因的過表達存在于多種惡性血液疾病，已成為監測AML微小殘留病灶的敏感指標[4-7]，但WT1基因與AML長期預后的關系還存在爭議[8-9]。作者通過監測初診AML患者骨髓WT1基因表達水平，并分析其與初次誘導化療緩解率(the complete remission rate after the first induction chemotherapy,CR1)及2 a無白血病生存率(leukemia-free survival rate,LFS)和2 a總生存率(overall survival rate,OS)的關系，探討其在AML預后分層和復發預測中的意義。

1 對象與方法

1.1研究對象選取鄭州大學第一附屬醫院血液科2010年1月至2012年1月門診或住院收治的AML患者122例，男68例，女54例，年齡16～70歲，中位年齡54歲。白血病的診斷均經臨床癥狀、血常規、骨髓細胞學及組織化學染色、免疫分型、染色體核型分析確診，部分患者行融合基因檢測，符合白血病形態學、免疫學、細胞遺傳學及分子學(MICM)診斷標準。122例患者同時經FAB分型，其中M0型3例，M1型5例，M2型53例，M3型32例， M4型14例， M5型15例。患者及家屬均同意接受規范方案治療。對照組21例，為同期就診的非白血病(過敏性紫癜、缺鐵性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、巨幼細胞性貧血)患者及造血干細胞移植健康供者。

1.2治療方案及療效標準AML-M3治療方法參照《急性早幼粒細胞白血病中國診療指南(2011年版)》[10]。AML(非M3)治療方法參照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2011年版)》[11]，應用標準量“DA”或“IA”方案作為初治誘導緩解方案，其后根據預后分層制定相應治療方案。根據1987年全國白血病化療討論會制定的白血病療效評價標準，以骨髓細胞形態學檢測幼稚細胞比例≥0.05，或存在且病理活檢證實髓外浸潤作為復發及未緩解標準。隨訪時間1～36個月，中位隨訪時間21個月。

1.3觀察指標CR1：根據初次誘導化療后3周骨髓細胞學檢查結果，以骨髓細胞形態學幼稚細胞<0.05且無髓外浸潤為化療緩解標準，計算化療緩解率。 2 a LFS：2 a觀察期內無白血病復發生存的概率,以復發為終點事件。2 a OS：2 a觀察期內的總生存率，以死亡為終點事件。

1.4WT1基因的檢測

1.4.1 總RNA的提取和逆轉錄反應 無菌條件下常規抽取對照組及AML患者治療前骨髓1～2 mL，0.5 mol/L EDTA抗凝，用常規Trizol方法提取總RNA，紫外分光光度計定量，-80 ℃凍存。逆轉錄反應采用TaKaRa逆轉錄試劑盒，按說明書操作。

1.4.2 引物和探針的設計、合成 引物及探針序列根據GenBank基因序列自行設計，由上海Invitrogen公司合成。WT1上游引物為5’-CAGGCTGCAATA AGAGATATTTTAAGCT-3’，下游為5’-GAAGTCA CACTGGTATGGTTTCTCA-3’，擴增片段大小為120 bp；探針序列為5’-CTTACAGATGCACAGCAGGAAG CACACTG-3’，5’端標記熒光發光基團，3’端標記熒光淬滅基團。內參ABL基因上游引物為5’-TG GAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’，下游為5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；探針序列為5’-CCATTTTTGGTTTGGGTTCACACCATT-3’。

1.4.3 陽性標準品的制備 從K562細胞(由鄭州大學干細胞中心提供)中提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA后，在PE9700 PCR儀上進行擴增。擴增條件：95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s， 35個循環。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠切割、回收并純化，連結到PUCm-T質粒，克隆后測序，證明連接產物為WT1基因片段。重組質粒體外克隆后混勻、紫外分光光度計定量，稀釋為104～106拷貝數，-20 ℃保存備用。同法制備內參基因陽性標準品。

1.4.4 熒光定量PCR 總反應體系20 μL：包括Premia Ex TaqTM 10 μL,上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，熒光探針0.8 μL，cDNA模版溶液2 μL，滅菌去離子水6.4 μL。反應程序：第一步42 ℃ 30 min，第二步94 ℃ 5 min，第三步94 ℃ 45 s，第四步60 ℃ 80 s，重復第三步到第四步40個循環。每批實驗均設立陰性及陽性對照。以WT1與內參ABL絕對拷貝數之比作為WT1基因的表達水平。

1.5統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。WT1基因表達水平呈非正態分布，用中位數(下，上四分位數)描述，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算2 a LFS和2 a OS,并進行log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1AML患者骨髓WT1基因的表達對照組骨髓WT1基因表達水平為0.007(0.002，0.080)；AML組為0.677(0.336，0.763)，明顯高于對照組(Z=2.620，P<0.001)。不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因的表達水平見表1。

表1 不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因的表達

2.2AML-M3患者WT1基因表達水平與預后的關系32例AML-M3患者在觀察期內，除4例初次誘導治療中出現顱內出血死亡，余28例均初治誘導達完全緩解，且該28例在觀察期內無復發及死亡發生。以WT1基因表達水平中位數0.853為界，<0.853為WT1低表達，≥0.853為高表達，則這28例患者在觀察期內，WT1基因高表達組與低表達組CR1、2 a LFS和OS相同。

2.3AML(非M3)患者WT1基因表達水平與預后的關系AML(非M3)患者90例，以 WT1基因表達水平中位數0.583為界，<0.583為WT1基因低表達，≥0.583為高表達。低表達組CR1為82．6%(38/46)，高表達組為52.3%(23/44)，差異有統計學意義(χ2=9.476,P=0.002)。兩組的2 a總生存曲線和無白血病生存曲線(圖1)差異有統計學意義(χ2=5.410,P=0.020；χ2=4.698,P=0.030)。高表達組2 a OS(36.0%)和LFS(33.3%)均低于低表達組(57.7%和53.7%)。

圖1 WT1基因高、低表達組的生存曲線

3 討論

WT1基因最早以抑癌基因被發現于腎母細胞瘤中，該基因位于11p13，編碼一種鋅指蛋白類的轉錄因子。AML中WT1基因異常過度表達已被國內外多中心研究所證實[5-6]，這也是WT1基因作為AML預后分層和復發預測的分子學標記的理論基礎。用WT1基因預測AML短期復發的靈敏性和特異性均優于傳統的流式細胞術方法[12]，但WT1基因與AML長期預后的關系還存在爭議[8-9]。此次研究通過比較AML患者骨髓WT1基因高表達組與低表達組間CR1、2 a LFS和OS的差異，探討該基因對AML長期預后的預測作用。結果顯示,WT1基因高表達的AML(非M3)患者組CR1、2 a LFS和OS均低于WT1基因低表達組，這與國外Nomdedeu等[8]的研究結果一致，但與Miglino等[9]的研究結果相悖，可能與病例數、分層及治療方案的不同有關。同時作者還發現AML-M3患者骨髓WT1基因表達水平與患者的預后并沒有相關性，這可能與該亞型的靶向治療藥物全反式維甲酸和三氧化二砷的應用有關[13]。靶向治療藥物出現后AML-M3患者的長期生存率明顯提高，因此成為在AML預后分層中相對獨立的一個亞型。目前WT1基因在AML中過表達的機制尚不清楚，現主要考慮有WT1基因啟動子去甲基化、GATA等轉錄因子的過度激活、WT1基因突變等[14-15]。WT1基因表達水平與AML-M3患者的預后沒有相關性這一結果也從一個側面證明WT1基因的高表達并不是該疾病發病的始動因素，可能是由于信號傳導通路中相關轉錄因子的改變影響了該基因的表達狀態，并進一步影響了下游基因的表達。

此次回顧性研究觀察時間1～3 a，相信隨著樣本數量的增加及觀察時間的延長,WT1基因與AML患者預后的關系會更明確。雖尚不能完全了解AML患者WT1基因過度表達的具體機制，但該基因在AML預后分層、微小殘留病灶監測甚至治療中的作用將會越來越重要。該研究中WT1基因高表達組及低表達組均采用標準預后分層及治療分案[10-11]，在下一步治療中如果采用加入WT1基因的預后分層系統，根據預后分層采取不同的治療分案，相信能獲得更好的長期生存率。另外與WT1基因相關的腫瘤疫苗[16]已在研制過程中，相信隨著研究的進一步深入，以WT1基因作為治療靶點的基因工程藥物也會越來越多。

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(2013-10-11收稿 責任編輯王 曼)

Prognostic value of WT1 expression in bone marrow for acute myeloid leukemia

WANDingming1)，BIANZhilei1)，LIUYanfang1)，CAOWeijie1)，ZHANGYuan2)，LITao1,3)，HEHaiyan1)，XUANZhongqian1)

1)DepartmentofHematology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

2)DepartmentofHematology，theFirstAffiliatedHospital，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453100

3)InstituteofHematology，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

acute myeloid leukemia；WT1 gene；prognosis

Aim: To investigate the relationship between WT1 gene expression level in bone marrow of acute myeloid leukemia (AML) patients and the prognosis. Methods: A total of 122 newly diagnosed AML patients were subjected to detect WT1 expression level in bone marrow by real time quantitative reverse transcription-PCR method,and the complete remission rate after the first induction chemotherapy(CR1), two-year leukemia-free survival rate(LFS) and two-year overall survival rate (OS) were calculated.A total of 21 cases of non-AML were the control.Results: The median expression level of WT1 in AML patients was 0.677(0.336,0.763), which was higher than that of control[0.007(0.002,0.080),Z=2.620,P<0.001]. With regard to AML-M3 patients,CR1, two-year LFS and OS of the patients with high expression level of WT1 was similar to those of the patients with low expression level of WT1.With regard to non AML-M3 patients, CR1 in the high WT1 expression group was 52.3%, lower than that of 82.6% in the low WT1 expression group(χ2=9.476,P=0.002);the two-year leukemia-free survival curve and overall survival curve of high WT1 expression patients differed from those of low WT1 expression patients(χ2=4.698,5.410,P<0.05),and two-year LFS and OS of high WT1 expression patients were 33.3% and 36.0%,lower than 53.7% and 57.7% of the low WT1 expression patients.Conclusion: WT1 expression level in bone marrow could be an useful prognosis marker for AML patients.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.027

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