奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對人H7N9流感病毒神經氨酸酶的抑制作用

蔚曉暉，劉 偉

鄭州大學生物工程系生命科學學院 鄭州 450001

奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對人H7N9流感病毒神經氨酸酶的抑制作用

蔚曉暉，劉 偉#

鄭州大學生物工程系生命科學學院 鄭州 450001

#通訊作者，男，1967年7月生，博士，教授，研究方向：生物信息學與藥物設計，E-mail: weiliu@zzu.edu.cn

H7N9流感病毒；神經氨酸酶；分子動力學；分子對接

H7N9流感病毒屬于甲型流感病毒，是一種新亞型流感病毒，2013年3月首次在人類中檢測出[1-2]。目前尚未有明顯證據表明該病毒可以在人與人之間傳播[3]，但H7N9病毒之間的遺傳變化表明其病毒較易傳播給人類，并且和SARS一樣可導致嚴重的呼吸道癥狀及死亡[4]。目前較常用的抗流感病毒藥物主要有奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋，它們可以通過抑制神經氨酸酶(neuraminidase,NA)來抑制流感病毒的繁殖。NA是一種流感病毒糖蛋白，能催化水解唾液酸末端的N-乙?；窠洶彼崤c鄰近寡糖D-半乳糖或是D-氨基半乳糖之間的α(2,6) 或α(2,3) 糖苷鍵，使成熟的病毒顆粒最終脫離宿主細胞，感染新的上皮細胞，造成流感病毒在患者體內的擴散。雖然甲型流感病毒NA活性中心的結構在流感病毒中是較為保守的，但流感病毒基因易重組突變，NA活性位點上氨基酸殘基的改變有可能使病毒對NA抑制劑產生明顯抗藥性[5-6]。因此，對NA藥物抑制特性的研究有助于對人感染H7N9流感病毒的防控工作。作者利用同源建模和分子對接方法，通過對藥物分子與H7N9 NA結合能的比較，分析藥物分子對NA的抑制作用。

1 材料與方法

1.1序列比對與同源建模從NCBI數據庫中獲得所有H7N9流感病毒NA的完整序列，包括6條人感染H7N9流感病毒NA序列，利用clustalx進行序列比對。選取人感染H7N9流感病毒A/Hangzhou/1/2013的NA序列(NCBI序列號：AGI60300.1, AGI)和其他來源H7N9流感病毒株A/wild bird/Korea/A3/2011的NA序列(NCBI序列號：AEK84752.2, AEK)進行同源建模。同源建模采用CPHmodels-3.2網絡服務器[7]，可獲得對應序列的三維空間結構。

1.2分子動力學平衡分子動力學模擬采用Amber11，蛋白質力場采用ff99力場[8]。NA模型在進行動力學模擬之前還需要利用Xleap程序進行處理，包括增加氫原子、增加抗衡離子以使體系中性化以及增加8.5 μm厚的基于TIP3P模型的八面體水環境。分子動力學過程優化分為兩個階段：首先約束溶質，對溶劑分子進行優化；再無約束優化整個系統。每個階段均采用最陡下降法優化2 500步，再采用共軛梯度法優化2 500步。優化之后用60 ps時間使系統緩慢升溫到298 K，在298 K下進行500 ps的體系平衡過程，平衡之后再進行1.5 ns分子動力學模擬，最后選取體系能量最低的構像狀態作為NA的穩定結構。按上述方法處理，分別獲得AGI和AEK的穩定結構。

1.3分子對接模擬從PDB數據庫里獲得野生型流感H5N1病毒NA與奧司他韋復合物(WT-OTV, PDB Code: 2HU4)的結構作為模板，然后將WT-OTV分別與平衡后的AGI和AEK的穩定結構進行疊加，刪除WT-OTV的NA,分別得到了AGI、AEK與奧司他韋復合物(AGI-OTV、AEK-OTV)的結構。同法獲得AGI、AEK分別與扎那米韋和帕拉米韋復合物(AGI-ZNV、AEK-ZNV和AGI-PRV、AEK-PRV)的結構。對獲得的6種復合結構，分別采用Autodock 4.0 程序[9]進行分子對接。對接選用的格點盒子大小為40點×40點×40點，格點間距0.375埃。運用Lamarckian 遺傳算法，對小分子進行100次的獨立對接實驗，能量極大值設為2.5×106，最大變異代數設為27 000，最后得到這些復合物與藥物小分子的結合能。

2 結果與討論

6條人感染H7N9病毒NA均出自長三角地區，序列比對的結果表明，序列相似度很高，而且在活性位點均未發生變異，由此初步判斷這次人感染H7N9病毒NA結構比較保守。除人感染H7N9流感病毒NA序列外，只有AEK序列在第118位活性位點發生了R到T的突變。

在分子動力學模擬過程中，為了判斷體系是否平衡，分別計算了動能、勢能、總能和NA的主鏈Cα原子的RMSD值。RMSD是指體系在模擬過程中產生的結構相對于晶體結構隨時間變化的均方根偏差，也是衡量體系是否穩定的重要依據。圖1表示的是NA主鏈Cα原子的RMSD值隨時間的變化值，其中，橫坐標表示的是時間，縱坐標表示的是RMSD值，由圖中可以看出時間大于350 ps以后，AGI和AEK的主鏈Cα原子的RMSD值達到1.5埃左右并保持平衡。同時體系動能、勢能和總能的變化迅速達到穩定值，AGI的動能、勢能和總能分別保持在62 760、-292 880、-230 120 kJ/mol，AEK分別保持在83 680、-376 560、-292 880 kJ/mol，表明AGI和AEK在500 ps的動力學模擬過程中都達到了平衡，因此，可從模擬的最后階段選取NA的穩定結構。

圖1 NA的主鏈Cα原子在平衡階段的動力學模擬的RMSD值變化

AGI和AEK與奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋的結合能如表1所示。從表1可以看出，奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對AGI的抑制作用比較明顯；而AEK與藥物分子的結合能力較AGI略大，第118位活性位點R到T的突變并未減弱藥物分子對AEK的抑制作用。3CL2是通過對NA和奧司他韋晶體結構(PDB Code: 3CL2)直接計算獲得的數值，該值直接反映了3CL2和奧司他韋之間較強的相互作用[10]，其與奧司他韋的結合能與AGI和AEK接近。上述結果說明奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋對人感染H7N9病毒株NA的抑制作用比較明顯。

表1 AGI和AEK與奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋的結合能 kJ/mol

綜上所述，人流感H7N9病毒株NA序列變化小，結構比較保守，未發生活性位點突變；藥物分子對其的抑制作用明顯，因此對H7N9流感病毒在體內釋放會有較好的抑制效果。但AEK活性位點的突變說明H7N9 NA有可能產生抗藥性突變，需引起關注。

[1]Alcorn, T. As H7N9 spread in China, experts watch and wait[J]. Lancet, 2013, 381(9875): 1347

[2]張寶,黃克勇,郭勁松,等.H7N9病毒的來源和重組模式[J].南方醫科大學學報,2013,33(7):1017

[3]Horby P.H7N9 is a virus worth worrying about[J].Nature,2013,496(7446):399

[4]From SARS to H7N9: will history repeat itself?[J]. Lancet, 2013, 381(9875):1333

[5]Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase[J]. Nature, 1983, 303(5912): 41

[6]McKimm-Breschkin JL. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors:a review[J].Antiviral Res, 2000, 47(1) : 1

[7]Nielsen M, Lundegaard C, Lund O, et al. CPHmodels-3.0-Remote homology modeling using structure guided sequence profiles[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(Web Serve issue): W576

[8]Duan Y, Wu C, Chowdhury S, et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations[J]. J Comput Chem, 2003, 24(16): 1999

[9]Morris G, Goodsell D, Halliday R, et al. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function[J]. J Comput Chem, 1998, 19(14): 1639

[10]Collins PJ,Haire LF, Lin YP，et al. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants[J]. Nature, 2008, 453(7199):1258

(2013-08-15收稿 責任編輯李沛寰)

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.046