Gen對類風濕關節炎RA患者BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG系統的影響

尚 辰,楊濱州,張 育,沈維干

(揚州大學臨床醫學院 風濕免疫科,江蘇 揚州,225001)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性、系統性的自身免疫性疾病，其特征是多關節的慢性炎癥，進行性的骨與軟骨破壞。該病在中國的患病率達0.32%～0.36%,是造成中國勞動力喪失和致殘的主要疾病之一。據文獻[1]報道,35% RA患者在10年內喪失工作能力。隨著對RA發病機制研究的深入，一些新的治療方法能很好地控制RA的炎癥。但如何有效預防和干預RA患者關節破壞，促進骨修復，改善患者的生活質量，仍然是RA研究的熱點。

來源于造血干細胞的破骨細胞過度分化和活化在RA骨破壞進程中起著至關重要的作用。近年來發現，核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)/核因子κB受體活化因子(RANK)/骨保護素(OPG) 系統與破骨細胞分化及活化過程密切相關。間充質干細胞(MSCs)能夠向炎癥和損傷部位“歸巢”，具有自我增殖、免疫調節和修復等功能[2],該特性和功能可能在RA骨破壞的修復中起到積極作用。

雌激素通過與雌激素受體結合而活化雌激素受體介導的信號通路來調控BM-MSCs的增殖和相關功能[3-4]。金雀異黃素(Gen)具有與雌激素相同的結構，藥理學研究發現其除了弱雌激素作用外，還具有其他藥理作用，如抗癌、抗炎、免疫調節及調節心血管系統等作用[5-6]。本研究前期已證實Gen能抑制RA大鼠關節的破壞[7],本文進一步觀察Gen對RA患者BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG系統的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

RA患者來源于揚州大學臨床醫學院風濕免疫科，符合1987年美國風濕病學會(ACR)的RA診斷標準，疾病處于高度活動期。健康對照組性別、年齡與RA組相匹配，無其他自身免疫性疾病，無心血管疾病、代謝性疾病、退行性疾病、血液病、腫瘤及遺傳病等可能影響實驗結果的疾病。

1.2 主要試劑、儀器及來源

Gen(上海融合醫藥科技發展有限公司),Ficoll淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物科技有限公司)，低糖DMEM培養液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，鼠抗人CD34-PE單克隆抗體、鼠抗人CD45-PE-Cy5單克隆抗體、鼠抗人CD29-PE單克隆抗體、鼠抗人CD90-FITC單克隆抗體(Becton Dickinson公司)，兔抗人RANKL多克隆抗體、兔抗人ER α多克隆抗體、兔抗人OPG多克隆抗體、兔抗人RANK多克隆抗體(Santa Cruz公司)，山羊抗兔IgG-HRP(上海康成生物工程有限公司)，山羊抗兔IgG-FITC(武漢博士德生物工程有限公司)，雌激素受體拮抗劑ICI182710(Toc-ris公司)，雌二醇(E2)(大連美侖生物技術有限公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，電泳儀、垂直電泳槽、轉印槽(Bio-rad公司)，酶標儀(Bio-Tek公司)，流式細胞儀(Becton Dickinson公司)，化學發光凝膠成像系統(ALPHA公司)。

1.3 BM-MSCs的分離、培養

髂后上棘取骨髓 5 mL,置于含0.5 mL肝素鈉(100 U/mL)的無菌小瓶，混勻，加入5 mL無血清DMEM培養液，制成細胞懸液。將細胞懸液置于等體積Ficoll分離液上,2 500 r/min離心30 min,吸取界面層，加入5倍體積的PBS,混勻,1 000 r/min離心8 min,PBS洗滌2次。DMEM培養液懸浮細胞，細胞計數后重懸于含10%FBS的DMEM培養液中，按1×105/mL的密度接種于25 cm2細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。48 h后半量更換培養液，以后每3 d換液1次。待細胞匯合接近80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，至第三代備用。用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態及生長情況。

1.4 BM-MSCs的鑒定

取傳代后的第3代BM-MSCs,培養至80%匯合時，胰蛋白酶消化細胞，用含10% FBS的培養液中和,1 500 r/min離心15 min,收集細胞,PBS洗滌3次，制成 1×105/mL細胞懸液。各取100 μL細胞懸液分別加入熒光標記的抗人CD34、CD45、CD25、CD90抗體標記，室溫孵育30 min,另設空白對照管，流式細胞儀鑒定。

1.5 Western Blot檢測RANK、RANKL、OPG的表達

根據預實驗MTT結果,Gen在濃度為1 μmol/L時對BM-MSCs無細胞毒性作用，所以作者選用1 μmol/L作為實驗終濃度。實驗分為4組：空白對照組(Con組，未處理)、Gen處理組(Gen組,1 μmol/L)、雌二醇處理組(E2組,0.01 μmol/L)和Gen+雌激素受體拮抗劑組(Gen+ICI組,Gen 1 μmol/L、ICI182710 0.1 μmol/L)。取傳代后第3代的正常人與RA患者的BM-MSCs,按分組加入藥物處理96 h后，提取細胞總蛋白，進行蛋白定量,SDS-PAGE,轉膜，一抗(RANKL、OPG工作濃度1∶200,RANK工作濃度1∶100,GAPDH工作濃度1∶4 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育2 h,ECL試劑盒顯色，化學發光凝膠成像系統獲得Western條帶，以GAPDH 為參照，ImageJ2x軟件對條帶吸光度值進行分析。

1.6 免疫熒光法免疫熒檢測雌激素受體α(ERα)細胞內分布情況

取傳代后的RA患者第3代BM-MSCs,分為Con組、Gen組、E2組，每組按5×104/孔濃度接種于覆蓋蓋玻片的24孔培養板中，培養48 h后，取出蓋玻片,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,0.5% Triton處理15 min,PBS洗滌3次,3%牛血清白蛋白封閉1 h,加入兔抗人ER α抗體(1∶200),置于濕盒中4 ℃過夜后,PBS洗3次，加入山羊抗兔IgG-FITC (1∶50)室溫孵育2 h,PBS洗滌3次，加入DAPI染色10 min,PBS洗滌3次，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 細胞形態觀察以及細胞表型鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察結果顯示,RA患者的BM-MSCs傳代后的細胞形態與成纖維細胞形態相似，呈長梭形，排列規則 (見圖1),符合人BM-MSCs的形態特征。流式細胞儀檢測第3代BM-MSCs中CD90陽性細胞率為99.7%,CD29陽性細胞率為99.9%,CD34陽性細胞率為0.9%,CD45陽性細胞率為1.8%(見圖2),符合BM-MSCs的基本特征標志，正常人的BM-MSCs的細胞形態及鑒定與RA患者的BM-MSCs特征是一致的。

圖1 生長匯合的RA患者的BM-MSCs 100倍

圖2 流式細胞儀檢測RA患者BM-MSCs表面抗原結果

2.2 Gen顯著上調BM-MSCs中OPG的表達

用Western blot方法檢測BM-MSCs中RANK、RANKL和OPG的蛋白表達水平，實驗結果由圖3和圖4所示。與正常人BM-MSCs相比，RA患者BM-MSCs中的RANK的蛋白表達水平明顯升高,OPG的蛋白表達水平明顯降低，數據分析顯示RANKL/OPG比值升高，提示BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG表達改變可能在RA骨質破壞的病理進程起著重要作用。Gen可以顯著上調正常人BM-MSCs中的OPG的蛋白表達(P<0.05),對RANK、RANKL的表達無明顯影響(P>0.05),效果與E2類似；數據分析表明Gen可以降低RANKL/OPG比值; Gen聯合雌激素受體拮抗劑處理正常人BM-MSCs后，與Gen組和E2組相比OPG蛋白表達降低(P<0.05),與Con組相比略有升高但差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。Gen同樣可顯著上調RA患者BM-MSCs中的OPG蛋白表達(P<0.05),對RANK、RANKL表達也無明顯影響(P>0.05),效果與E2類似；同時，數據分析也顯示Gen可降低RANKL/OPG比值; Gen聯合雌激素受體拮抗劑處理RA患者的BM-MSCs后，與Gen組和E2組相比OPG蛋白表達水平有所降低(P<0.05),但其表達水平仍高于Con組 (P<0.05)(圖4)。

2.3 Gen可以促進RA患者BM-MSCs的ERα入核

Gen作用RA患者BM-MSCs 48 h后，免疫熒光檢測ERα細胞內分布情況。結果顯示: Gen與E2可顯著促進ERα進入細胞核(圖5),提示Gen可能通過與ERα結合，促進ERα進入細胞核。

A: RANK、RANKL、OPG、GAPDH的蛋白表達水平; B: 對應的RANK、RANKL、OPG相對于GAPDH灰度值比值; C: 各處理組RANKL/OPG比值。與Con組比較,△P<0.05。

A: RANK、RANKL、OPG、GAPDH的蛋白表達水平; B: 對應的RANK、RANKL、OPG相對于GAPDH灰度值比值; C: 各處理組RANKL/OPG比值。與Con組比較,△P<0.05; 與Gen組和E2組比較,*P<0.05。

圖5 Gen促進RA患者BM-MSCs的ERα入核

3 討 論

關節周圍骨質疏松和全身骨質流失在RA患者中甚為常見。炎癥因子破壞骨髓微環境對BM-MSCs造成損傷是RA導致病理性骨質疏松的重要原因[8]。BM-MSCs作為骨髓微環境中的重要細胞組分，表達多種具有造血細胞調控能力的細胞因子，通過直接或間接的方式調控造血細胞的分化與成熟。成骨細胞起源于BM-MSCs[9]，破骨細胞起源于造血干細胞，骨髓微環境中RANKL/OPG可能決定了破骨細胞的分化和成熟[10-11]。RA骨質破壞可能是由于骨髓微環境中的成骨細胞分化受到抑制，破骨細胞過度分化成熟所致[8]。這些研究結果提示了BM-MSCs在RA的骨質破壞中起著重要作用。本研究選擇正常人和RA患者的BM-MSCs為研究對象，通過分離培養得到正常人和RA患者的BM-MSCs,顯微鏡觀察顯示細胞呈成纖維樣、漩渦狀生長，符合BM-MSCs的形態特點，表面抗原CD29、CD90陽性率超過95%,CD34、CD4陽性率低于2%,符合BM-MSCs基本特征標志，可用于本實驗研究。

RANKL/OPG/RANK系統在骨重建中起著重要作用，通過RANK/RANKL/OPG系統介導的破骨細胞造成的骨質破壞在RA的病理進程中發揮重要作用[12]。有研究[13]顯示,RA患者血清、關節滑液中OPG水平降低,RANKL/OPG比值升高。而RANKL/OPG的平衡決定了破骨細胞活化和增殖的水平[10],因此RA患者RANKL/OPG比值升高可能介導了骨質破壞。本組研究發現，與正常人BM-MSCs相比,RA患者BM-MSCs中的RANK的蛋白表達水平明顯升高,OPG的蛋白表達水平明顯降低，數據分析顯示其RANKL/OPG比值升高。本研究前期已發現Gen可抑制CIA大鼠的骨質破壞[7],考慮到BM-MSCs在RA的骨質破壞中起著重要作用，因此本文在體外細胞水平進一步探討Gen是否通過對BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG系統的調控而起到抑制RA骨質破壞的作用。研究結果表明，Gen可顯著上調RA患者BM-MSCs的OPG蛋白表達，而對RANK、RANKL蛋白表達無明顯影響，提示Gen可能通過調控RA患者的BM-MSCs中OPG的表達，降低RANKL/OPG的比值，從而抑制破骨細胞過度活化和分化，最終抑制RA患者關節骨質破壞。

Gen是一種植物雌激素，可能通過雌激素樣作用在卵巢切除小鼠骨質疏松模型中影響骨質代謝[14]。本研究結果顯示,Gen和E2對RANK/RANKL/OPG表達的影響類似；同時免疫熒光結果顯示: Gen可顯著促進RA患者的BM-MSCs中ERα入核，提示Gen可能通過促進ERα入核，活化ERα介導的相關信號通路，上調OPG的表達，進而影響RANKL/OPG的比值。為進一步驗證Gen是否通過活化ERα介導的相關信號通路起作用，本文使用Gen聯合雌激素受體拮抗劑ICI182710處理BM-MSCs,Western Blot結果顯示與Gen組和E2組相比，其OPG蛋白表達水平降低，但與Con組相比，其OPG蛋白表達水平升高,Gen促進OPG蛋白表達的作用并沒有被完全抑制。這些結果提示Gen除了通過活化ERα介導的相關信號通路影響RANKL/OPG的比值，可能還通過其他信號通路發揮調控作用。

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