SLP-2基因在乳腺癌細胞系中的表達及對MCF-7細胞增殖的影響

謝貴娥，黃招琴，李 莉，徐 甜, 張 航，韓 梅，向雙林

(湖南師范大學生命科學學院，中國，長沙 410008)

SLP-2基因在乳腺癌細胞系中的表達及對MCF-7細胞增殖的影響

謝貴娥，黃招琴，李 莉，徐 甜, 張 航，韓 梅，向雙林*

(湖南師范大學生命科學學院，中國，長沙 410008)

人的SLP-2基因在乳腺癌組織的高表達與病人的存活率相關．為了研究SLP-2在乳腺癌中的功能，應用免疫印記的方法檢測SLP-2在不同乳腺癌細胞中的蛋白表達水平，發現隨著細胞癌化程度的增強其表達也增強. 成功構建pCMV-Myc-SLP-2重組質粒，證明了其在MCF-7細胞的表達，MTT實驗結果表明SiRNA轉染乳腺癌細胞MCF-7可以抑制細胞增殖，同時發現SLP-2在乳腺癌細胞系中表達量與HER2/nue呈負相關．這些結果為深入研究乳腺癌的發生和發展奠定了基礎．

乳腺癌；SLP-2；免疫印記；細胞增殖

乳腺癌是嚴重威脅婦女身體健康的常見惡性腫瘤之一，其發生的分子機制尚不明確[1-2]．人的Stomatinlikeprotein2(SLP-2)基因由Wang首先從人心臟cDNA文庫中克隆，由10個外顯子和9個內含子組成，編碼約1.5 kb的mRNA形成含有356個氨基酸的多肽[3]．該蛋白在人體組織中都有表達，其中在心臟和骨骼肌中表達較高．研究表明SLP-2在多種惡性腫瘤組織中表達較高，如上皮性卵巢癌組織和食管鱗狀細胞癌組織，且有研究報道，SLP-2基因與子宮內膜腺癌細胞生長相關[4-6].有研究表明在乳腺癌組織中，病人的存活率與SLP-2的高表達負相關，因此在乳腺癌的發生中SLP-2基因很可能發揮著重要作用[2，7]．在本研究中，作者通過Western blotting分析SLP-2基因在乳腺癌細胞系中的表達水平，發現癌化程度越高的細胞中SLP-2表達越高，并運用脂質體介導法將外源SLP-2基因轉染入人乳腺癌MCF-7細胞系中,使之得到穩定表達,以探討SLP-2基因在乳腺癌細胞增殖中的作用．這些實驗結果為從乳腺癌細胞增殖周期入手來探討乳腺癌治療新途徑打下了實驗基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α，細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453均為本實驗室保存, pCMV-Myc(載體)為Clontech公司產品；pMD18-T(vector)購自Takara公司；反轉錄試劑盒及EXTaqDNA聚合酶購自Qiagen公司；各種限制性內切酶以及T4DNA連接酶等購自New England Biolabs公司； LipofectamineTM2000轉染試劑盒和DMEM 培養基購自Invitrogen 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；Myc單抗和碘化丙啶(propidium iodine, PI) 為Sigma 產品；SLP-2多抗購自Proteintech Group公司；anti-Myc單抗購自Sigma 公司；GAPDH的單抗購自Santa Cruz公司；actin的單抗購自Boster生物公司．

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增以及重組載體的構建 根據GenBank中小鼠SLP-2基因序列設計特異性引物, 其反向引物為5′GGTACCGTCCCCAGACTCCCTGGCC 3′正向引物為5′-GGAATTCATGGGAAATGCTGGCGCG-3′,(引物中劃線部分的堿基序列分別為KpnI和EcoRI的酶切位點)．以人腦cDNA 文庫為模板，進行常規PCR, PCR擴增的反應條件為：94 ℃×5 min; 94 ℃×30 s，60 ℃×30 s, 72 ℃×1 min, 30個循環，72 ℃×10 min結束擴增．1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離純化PCR 產物, 然后先直接連接到pMD18-T載體上，再用KpnI和EcoRI雙酶切消化、分離、純化，將純化得到的SLP-2目的片段與真核表達載體pCMV-Myc連接．酶切驗證, 選擇鑒定正確的質粒送上海生工公司測序，確認序列的正確性．

1.2.2 細胞培養 在37 ℃及5%CO2條件下置于培養箱中用DMEM 完全培養基(補加10%新生牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和2 mol/L谷氨酰胺)培養MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453細胞．

1.2.3 細胞轉染和Western-blot檢測 用購自Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉染試劑將pCMV-Myc-SLP-2 質粒和SiRNA轉染(方法參考LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書)到MCF-7細胞．轉染后培養24～72 h，收集細胞并抽提總蛋白．取50 μg變性蛋白進行SDS-GAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，分別用anti-Myc單抗(1∶1 000 稀釋和SLP-2為一抗，用辣根過氧化物酶標記的羊抗IgG(1∶1 000 稀釋) 為二抗進行免疫反應，最后用化學發光法顯影．

1.2.4 MTT檢測細胞活力 MCF-7細胞分別于轉染NC RNA和SiRNA后24、48和72 h，用MTT檢測細胞活力．實驗分組：MCF-7細胞組、NC RNA組、SiRNA組，在酶聯免疫監測儀上使用490 nm波長進行檢測，記錄吸光度，每組3個平行孔．對數據進行統計學分析．以A值為縱坐標，以時間為橫坐標作細胞生長曲線．

1.2.5 統計分析 數據以均值±標準差表示，采用方差分析，檢驗水準(α)定為0.05，用SPSS 13.0軟件處理．

2 結果與分析

2.1 不同侵襲轉移能力的乳腺癌細胞間SLP-2的表達水平

MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞株都是人乳腺癌細胞，它們的侵襲轉移能力和癌化程度按以上順序逐漸增強．收集此3種細胞，提取細胞總蛋白經過Western blotting檢測內源SLP-2的表達情況，結果表明隨著細胞癌化程度的增強，SLP-2表達水平也相應增強．GAPDH作內參(見圖1)．

2.2 SLP-2對人乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖的影響與調節作用

2.2.1 Western檢測SiRNA干擾后不同時間SLP-2表達水平 為了研究SLP-2在乳腺癌細胞MCF-7中的作用，作者設計了SiRNA干擾SLP-2的表達．用NC RNA和SiRNA轉染MCF-7細胞組以及MCF-7細胞組(Mock)，分別于24、48和72 h收細胞做Western檢測SLP-2的表達情況(如圖2)．Western結果顯示，24 h時干擾效果不太明顯，隨著時間的推移，干擾效果越來越明顯，72 h時干擾效果最好．

圖1 Western blotting方法檢測SLP-2蛋白在不同乳腺癌細胞中的表達Fig.1 The expression of SLP-2 protein in different breast cancer cell lines detected by Western blotting

圖2 Western檢測干擾后不同時間SLP-2的表達水平Fig.2 The expression of SLP-2 after RNA interference by Western blotting

2.2.2 MTT檢測SLP-2對人乳腺癌細胞MCF-7細胞活力的影響 分別比較NC RNA和SiRNA轉染MCF-7細胞組以及MCF-7細胞組(Mock)的細胞增殖能力，結果發現SiRNA干擾組的吸光度低于NC RNA轉染組和MCF-7細胞組(見圖3)，二者增殖活性比較，差別有統計學意義(P≤0.001)，說明SLP-2可以增強乳腺癌細胞活力．MTT結果顯示，轉染后48 h效果開始顯現，72 h效果最佳，與Western干擾效果相符．

2.3 SLP-2與HER2/nue相關性研究

2.3.1SLP-2過表達載體的構建及表達檢測 以人腦cDNA 文庫為模板，用SLP-2特異性引物進行PCR 擴增，獲得SLP-2 基因編碼區片段，1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示其分子大小與1 071 bp預期值一致，且陰性對照中無此大小的條帶(資料未顯示)．將線性pCMV-Myc及回收的SLP-2片段以T4DNA連接酶進行連接，連接產物經轉化大腸桿菌DH5α并用氨芐青霉素篩選擴增, 提取質粒，用KpnI和EcoRI 酶雙切，產生1 071 bp左右的DNA條帶，與預期相符(見圖4)，說明目的片段SLP-2已成功插入pCMV-Myc的多克隆位點上．

圖3 MTT檢測SLP-2蛋白表達水平對MCF-7細胞增殖的影響Fig.3 The effect of the expression of SLP-2 protein on the cell growth of MCF-7 by MTT

圖4 重組質粒pCMV-Myc-SLP-2的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-SLP-2 by digestion

利用脂質體lipofectamine 2000將質粒pCMV-Myc-SLP-2轉染入人乳腺癌細胞MCF-7，24 h后收集細胞，提取細胞總蛋白用anti-Myc單抗進行Western分析外源SLP-2的表達．SLP-2基因編碼的天然蛋白分子含356個氨基酸，相對分子質量為39 000，加上Myc接頭和多克隆位點表達的氨基酸，則大小為42 000左右．Myc單抗檢測轉染了pCMV-Myc-SLP-2的細胞組應在42 000左右有條帶，而轉染空質粒pCMV-Myc組和Mock組是沒有明顯條帶的，結果與預期相符(見圖5)，GAPDH作內參．結果提示，利用lipofectamine 2000轉染的pCMV-Myc-SLP-2重組質粒后，可在人乳腺癌細胞MCF-7中高表達SLP-2．

2.3.2 MCF-7細胞中SLP-2與HER2/nue基因表達量的關系neu基因編碼一種與表皮生長因子受體同源的磷酸蛋白, 具有酪氨酸激酶的活性，在多種癌細胞中發現有neu基因的擴增和過量表達．為了探究乳腺癌細胞系MCF-7中SLP-2與HER2/neu基因的關系，利用脂質體lipofectamine 2000分別將pCMV-Myc空載體和質粒pCMV-Myc-SLP-2轉染入MCF-7細胞，過表達SLP-2蛋白，48 h后收集細胞，Western分析SLP-2與HER2/nue基因表達量的關系．Western結果顯示：SLP-2與HER2/nue基因呈現負相關的關系，說明在MCF-7細胞中過表達SLP-2可以抑制HER2/nue的表達．

圖5 pCMV-Myc-SLP-2在人乳腺癌細胞MCF-7細胞中的表達Fig.5 The expression of pCMV-Myc-SLP-2 in human mammary cancer cells MCF-7

圖6 Western檢測MCF-7細胞中SLP-2與HER2/nue表達量的關系Fig.6 Correlations between SLP-2 protein and HER2/nue detected by Western blotting

3 討論

SLP-2是stomatin基因家族的一員[8]，在脊椎動物中的同源基因有兩類，分別是SLP-1和SLP-3．其中SLP-1主要分布在大腦，SLP-3是從嗅覺上皮中分離的嗅覺神經元蛋白[9]．Stomatin家族的基因都具有決定stomatin基因家族的一致氨基酸序列和N端的疏水性結構域，這表明它們可能作為細胞骨架和離子通道之間的連接分子，從而影響通道質膜的組織和穩定性[5]．因為SLP-2基因具有stomatin家族的共有氨基酸序列，而缺乏N端疏水性結構域，所以它可能作為外周膜蛋白將其他細胞骨架蛋白與膜蛋白連接起來，調控離子通道的傳導等[5,10]．而現有的研究數據表明，SLP-2基因在多種人類惡性腫瘤中高表達，比如食管癌、宮頸鱗癌等，很可能是一種腫瘤相關蛋白[4-7，11]，同時還發現SLP-2與腫瘤的侵襲、轉移過程密切相關[4]．而SLP-2基因在乳腺癌組織的高表達還與乳腺癌病人的存活率呈負相關性，這說明SLP-2基因在乳腺癌的發生中發揮重要作用，但其在乳腺癌中具體的作用機制還不清楚．

為了進一步研究SLP-2基因的功能，有必要構建其真核表達載體并檢測其在乳腺癌細胞中的表達水平．本文通過免疫印記的方法分析SLP-2在乳腺癌細胞系中的表達水平，發現SLP-2的表達隨著乳腺癌細胞癌化程度的增高而遞增．然而，用SiRNA干擾SLP-2的表達，發現24 h干擾效果很小，48 h效果顯著，72 h效果最佳，與Wang等[12-15]在食管鱗狀癌細胞中的研究結果一致．MTT法檢測其對MCF-7細胞活力的影響，結果表明SiRNA干擾后細胞活力受到抑制，即SLP-2可以增加細胞活力．

在探究SLP-2與HER2/neu基因的關系時，作者過表達SLP-2蛋白發現HER2/neu表達受抑制，SLP-2能下調HER2/neu的表達．HER2/neu是一種癌基因，在多種癌細胞( 如乳腺、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、肺、十二指腸、胃、胰、鼻咽、唾液腺等的癌變細胞) 中發現有neu基因的擴增和( 或) 過量表達[16]，成為癌癥的重要預后因子．在乳腺癌中，HER2/neu表達量與乳腺癌的轉移情況有重要相關性，曹等[2，7]發現在乳腺癌中，缺少HER2/neu基因表達的情況下，SLP-2可以促進淋巴結轉移．作者發現在乳腺癌細胞中，隨著癌化程度的升高SLP-2的表達量也會上升，而在乳腺癌細胞系MCF-7中過表達SLP-2會使HER2/neu表達量下降，與曹等觀點一致．在很多癌癥中，HER2/neu表達量與癌癥轉移成正相關，與病患術后5年生存率成反比，然而在乳腺癌中HER2/neu表達量與癌癥轉移成負相關，而具體的機制還不清楚，進一步探索其機制對乳腺癌治療具有重大意義．

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(編輯 王 健)

Expression ofSLP-2 in Human Mammary Cancer Cell Lines and Its Effect on Cell Proliferation in MCF-7 Cells

XIEGui-e,HUANGZhao-qin,LILi,XUTian,ZHANGHang,HANMei,XIANGShuang-lin*

(College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

High-level Humanstomatinlikeprotein2 (SLP-2) expression was associated with significantly decreased survival in breast cancer. To study the function ofSLP-2 in breast cancer furtherly, the expression ofSLP-2 protein was detected in different breast cancer cells by western blotting, and the expression of its protein in breast cancer cells was found to increase with the increase of the degree of cancer. Recombinant plasmid pCMV-Myc-SLP-2 was successfully constructed and demonstrated that it can express well in MCF-7. The MTT assay showed that the cell proliferation was significantly inhibited after transfection of pCMV-Myc-SLP-2, the expression ofSLP-2 was negatively correlated withHER2/nuein MCF-7, thus providing a useful clue to further research on the occurring and development of breast cancer.

breast cancer;SLP-2; western blotting; cell proliferation

2014-01-20

湖南省研究生創新性課題資助項目(CX2012B225)

*

,E-mail：xshlin@hunnu.edu.cn

Q78

A

1000-2537(2014)06-0019-05