細胞代謝組學用于木犀草素抑制MCF7細胞的機制研究

史棟棟等

摘要基于氣相色譜質譜聯用（GCMS）技術將代謝組學的方法結合細胞周期的實驗，研究木犀草素作用于MCF7細胞的作用機理。細胞活性實驗驗證， 木犀草素對MCF7細胞有抑制作用，GCTOF/MS對加藥細胞和未加藥細胞代謝物進行指紋圖譜分析，并進一步應用偏最小二乘判別分析（OPLSDA）對代謝組學數據進行多維統計分析。結合木犀草素將細胞周期抑制在S期（Synthesis），推測木犀草素通過阻礙核酸代謝中的磷酸戊糖途徑抑制MCF7細胞的增殖。

關鍵詞氣相色譜質譜聯用； 細胞代謝組學； MCF7 細胞； 細胞周期； 乳腺癌； 木犀草素

1引言

細胞代謝組學是以腫瘤細胞作為代謝組學研究對象，通過體內體外因素的作用，對生物體內代謝物的變化進行定量分析，尋找代謝物類型和數量變化與生理及病理變化的相互關系和動態規律＼[1＼]。用代謝組學的方法研究中藥活性物質引起的內源性代謝物的變化，發現潛在的生物代謝差異物，闡明藥物的作用機制，具有獨特的優勢＼[2＼]。

素作用于乳腺癌MCF7細胞的機理進行深入研究，從代謝組學的角度為木犀草素的抗腫瘤機制提供新的線索。

2實驗部分

21儀器與試劑

FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；CO2培養箱、全自動酶標分析儀（美國Thermo公司）；PEGASUS 4D GC×GCTOFMS（美國LECO公司）；LNGT88臺式快速離心濃縮干燥器（太倉市華美生化儀器廠）；L35低溫冷阱（太倉市華美生化儀器廠）；XW80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔培養板（丹麥Nunc公司）。

胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM/HIGH GLUCOSE DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（賽默飛世爾生物化學制品有限公司（北京））；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、RNaseA酶、甲氧胺、2氯苯丙氨酸（Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；吡啶（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硅烷化試劑BSTFA（含1%三甲基氯硅烷TMCS）。人乳腺癌細胞MCF7購于中國科學院上海細胞庫。

22MTT實驗測藥物對細胞增殖的影響

MCF7細胞培養，傳3代后，取對數生長期細胞，加入025%胰蛋白酶浸潤所有細胞表面后，吸出，于5% CO2培養箱中37 ℃消化3～5 min。加入3 mL含血清培養基終止消化后，接種于96孔板，每孔100 μL（3×103～4×103個cell/孔）。培養12 h后，加藥，藥物濃度梯度為： 10， 25， 50， 100和200 mg/L。每孔5個平行。設置時間梯度為24，48和72 h，分別考察藥物濃度和作用 時間對細胞增殖的影響。

25數據統計方式

將GCMS獲得的所有原始質譜數據通過ChromaTOF軟件（v330， Leco Co， CA， USA）轉化成CDF格式，然后用ChromaTOF軟件對數據進行峰識別、峰對齊、基線矯正、峰面積歸一化預處理。導入SIMCAP 115 軟件進行多維分析。在本實驗中采用OPLSDA模型區別各組代謝物差異。結合評價OPLSDA模型質量的3個關鍵指標（R2X，表示模型概括X矩陣結實率；R2Y，反應建模穩定性；Q2Y反應模型預測性；其中R2Y和Q2Y越接近1，說明模型穩定性和預測性越好）。根據OPLSDA模型得到的變量權重值（Variable importance in the projection， VIP）找到潛在的代謝差異物，VIP>1。實驗中采用了t檢驗，驗證多維統計中得到的差異物是否具有顯著差異。搜索數據庫為NIST數據庫。

為得到更多的代謝產物，必須將細胞破壁，將產物得以釋放，才能進一步提取。因此，細胞破碎是提取胞內產物的關鍵步驟＼[7＼]。本實驗采用超聲破碎的方法，對超聲時間進行了優化。最后采取3 min，5 s開，5 s關進行超聲，在這個時間內既可以提取到多的細胞代謝物，又不會因產熱太多導致代謝物發生變化。

33基于GCTOF/MS技術的木犀草素作用于MCF7細胞后的代謝組學分析

基于細胞代謝組學中細胞代謝物的考察均是在活細胞的基礎之上，綜合考慮羽扇豆醇對MCF7細胞的抑制作用，最終的作用濃度為50 mg/L，作用時間24 h。GCMS優良的定性和定量分析能力，加上其龐大的化合物譜庫，為鑒定工作帶來了很大便利，使其在代謝組學研究中具有突出優勢＼[8，9＼]。圖2為典型的MCF7細胞的GCTOF/MS代謝物譜圖，在S/N=10時，MCF7細胞的代謝譜圖分子特征峰個數在500～600之間。

MCF7細胞分別用木犀草素作用6， 12和24 h后，在上述優化的色譜條件下，分別對細胞樣品進行分析，采集GCTOF/MS數據并進行多維統計處理。

在上述通過代謝組學發現的差異物中，DRibose的代謝與磷酸戊糖代謝途徑（Pentose phosphate pathway）有關。磷酸戊糖途徑生成具有重要生理功能的5磷酸核糖（DRibose5phosphate）和NADPH＼[12＼]。具體為磷酸戊糖途徑以6磷酸葡萄糖開始，經過葡糖6磷酸脫氫酶、葡萄糖內酯水解酶、6磷酸葡萄糖酸脫氫酶的催化下生成5磷酸核酮糖，5磷酸核酮酶可以在5磷酸異構酶的作用下生成5磷酸核糖，5磷酸核糖為核酸和核苷酸的合成提供核糖基團。DRibose的含量下降，說明其來源5磷酸核糖的含量也有所下降，從而使得合成核酸和核苷酸的原料減少，抑制了S期DNA的復制。

最直接聯系核苷酸合成和糖代謝的物質是1磷酸葡萄糖，1磷酸葡萄糖可以在磷酸異構酶的作用下生成6磷酸葡萄糖，從而進行核酸的合成。核酸的合成途徑受到阻滯，導致大量1磷酸葡萄糖參與到糖代謝，使得DGalactose的含量大幅度生長。在核酸的酶促降解過程中會有磷酸生成，推測木犀草素抑制了核酸酶及其核酸苷酶的活性，從而使磷酸（Phosphoric Acid）的含量下降。

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構成細胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結論

以GCMS聯用技術為平臺，通過多元統計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細胞后細胞代謝物的變化。結果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質進行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結合木犀草素將MCF7細胞抑制在S期（主要進行DNA的復制）的細胞實驗結果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細胞的增殖。

本研究利用代謝組學的方法研究中藥活性物質作用于細胞的生物化學變化，并且與傳統手段的測定結果相聯系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學學報， 2010， 39（1）： 30-36

6Sana T R， Waddell K， Fischer S M J Chromatogr B， 2008， 871： 314

7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

8Lenz E M， Wilson I D Journal of Proteome Research， 2007， 6（2）： 443-458

9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構成細胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結論

以GCMS聯用技術為平臺，通過多元統計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細胞后細胞代謝物的變化。結果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質進行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結合木犀草素將MCF7細胞抑制在S期（主要進行DNA的復制）的細胞實驗結果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細胞的增殖。

本研究利用代謝組學的方法研究中藥活性物質作用于細胞的生物化學變化，并且與傳統手段的測定結果相聯系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學學報， 2010， 39（1）： 30-36

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7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

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9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

綜合分析，核酸是承載物體遺傳信息的構成細胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滯了核酸的代謝。

4結論

以GCMS聯用技術為平臺，通過多元統計分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7細胞后細胞代謝物的變化。結果表明，加藥組和未加藥組存在顯著的差異，對具有顯著性差異的物質進行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10種代謝差異物。結合木犀草素將MCF7細胞抑制在S期（主要進行DNA的復制）的細胞實驗結果，推測木犀草素主要通過阻滯磷酸戊糖代謝途徑中酶的活性來抑制細胞的增殖。

本研究利用代謝組學的方法研究中藥活性物質作用于細胞的生物化學變化，并且與傳統手段的測定結果相聯系，為藥物的機理研究提供了一種新的有效平臺。

王洪燕， 全 康， 蔣燕靈， 吳加國， 唐修文 浙江大學學報， 2010， 39（1）： 30-36

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KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin