微懸臂梁適配子傳感器檢測維埃克斯、沙林及動力學分析

劉志偉等

1引言

維埃克斯（VX）、沙林（GB）作為神經性毒劑，具有高效強毒、快速殺傷的特點。檢測VX和GB常用的方法有色譜法、色譜質譜聯用法和波譜法等，這些方法的檢測靈敏度雖然很高，但樣品處理繁瑣，分析時間長、成本高，且所需儀器復雜、價格昂貴、龐大笨重，需要專業技術人員操作和維護，不適用于現場快速檢測＼[1～3＼]。目前含磷毒劑生物傳感器具有體積小、響應靈敏、快速、一般不需要對樣品進行預處理等優點，已廣泛用于毒劑的現場檢測中，但這類傳感器一般采用膽堿酯酶作為分子識別物質，對所有能抑制膽堿酯酶活性的含磷毒劑和氨基甲酸酯均有響應，無法區分毒劑種類＼[4＼]。

適配子（Aptamer）是人工合成的單鏈寡核苷酸，具有親和力高、特異性強、穩定性好及制備容易等優點，在生物傳感器中作為一種新的分子識別物質正受到越來越多的重視[5，6]。壓阻式微懸臂梁將壓阻材料集成于微懸臂梁中，通過惠斯通電橋將微懸臂梁的彎曲直接轉換為電壓信號進行輸出＼[7＼]。由于壓阻式微懸臂梁讀出方式簡單、易于集成，成本低，體積小，在生化分子的現場檢測中具有很好的發展前景＼[8，9＼]。目前，有關微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學分析方法尚未見文獻報道。本研究的目的在于： （1）利用毒劑特異性的VX和GB適配子，建立一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的新方法，實現對VX和GB的高靈敏特異性檢測，以解決現有含磷毒劑生物傳感器無法區分毒劑種類的缺陷； （2）創建壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應動力學模型，為傳感器的數據處理、噪聲及非特異性信號干擾的排除提供理論依據。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

壓阻式微懸臂梁檢測平臺由本室與北京大學微電子學研究院共同搭建（壓阻式微懸臂梁傳感芯片：長200 μm，寬50 μm，厚約1 μm）。VX和GB的甲醇儲備液、VX適配子（5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGGTTTTTATTTTATCTTTGATTACTGTTTTTTTGTTTAGTTGTGTTGGTGGAGCGATTTGT3′）、GB適配子（5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGTTGGGACTGCCACTTTGTGTTTTGGTTATAGTACTTATTTGCGTTGGTGGAGCGATTTGT3′）均由本實驗室制備；活化生物素（BiotinNHS ester）、3，3，二巰基丙酸（DDPA）、1乙基3（3二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、親和素（Avidin）、乙醇胺（Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海國藥集團有限公司）；PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）；其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2實驗方法

2.2.1微懸臂梁適配子傳感器的構建將芯片置于檢測池中，加入DDPA（5 g/L），反應1 h，使芯片表面金膜包被上羧基；以水清洗芯片及檢測池，加入EDC（5 g/L）和NHS（5 g/L），反應0.5 h，完成對微懸臂梁表面的羧基活化修飾；清洗芯片后自然晾干，滴加20 μL 100 mg/L 親和素，反應0.5 h；清洗后滴加20 μL 1 mol/L 乙醇胺，反應0.5 h以滅活金膜表面殘余的活化羧基；清洗后將芯片置于含PBS緩沖溶液的檢測池中，加入2 μmol/L生物素化的VX和GB適配子，反應2 h，清洗芯片及檢測池。

2.2.2VX和GB的檢測將構建好的傳感芯片置于含0.01 mol/L PBS緩沖溶液的檢測池中，待信號穩定后，加入不同濃度的VX或GB（一個芯片測量一個濃度），記錄傳感器的響應電壓。另以0.01 mol/L PBS及200 μg/L O丁基甲基膦酰氯作為對照，考察傳感器的特異性。

2.2.3微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB毒劑動力學模型的建立與分析

根據配體、受體結合的假一級動力學方程與壓阻式微懸臂梁輸出電壓變化和受力關系的特性，推導出壓阻式微懸臂梁適配子傳感器輸出電壓變化與時間之間的動力學模型。根據建立的動力學模型對VX和GB的實際檢測數據進行擬合，由擬合方程求出傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡時的響應電壓（ΔUe）及響應時間（t0），分析模擬值與實測值之間的關系。

2.2.4VX和GB典型模擬樣品的測定

3結果與討論

3.1微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB

利用構建好的微懸壁梁適配子傳感器對不同濃度的VX和GB進行檢測，結果見圖1。

當VX濃度為60， 30和20 μg/L時，傳感器響應信號（輸出電壓變化）分別為55.8， 21.5和12.5 μV； 當VX的濃度進一步降至4和2 μg/L時，傳感器響應信號為4.5和3.1 μV，再進一步降低VX濃度至1 μg/L時，基本接近噪音信號（約1 μV），因此確定傳感器對VX的檢出限為2 μg/L（S/N≥3）。在2～60 μg/L濃度范圍內， 微懸臂梁傳感器響應信號（輸出電壓變化，ΔUe）隨VX濃度（C）增加而增大，呈線性關系，其線性回歸方程為ΔUe=0.886C-1.039（n=5，R=0.984， p<0.001）。

以相同方法對GB進行檢測，確定傳感器對GB的檢出限為10 μg/L（S/N≥3）。在10～60 μg/L濃度范圍內，微懸臂梁傳感器響應信號與GB濃度呈線性關系，其線性回歸方程為ΔUe=0.716C-2.304（n=5， R=0.996， p<0.001）。

對照實驗表明，加入0.01 mol/L PBS作為空白對照及與VX和GB結構非常相似的O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）作為干擾時，傳感器基本無響應，表明傳感器具有很好的特異性與抗干擾能力。對20 μg/L VX重復3次測定，傳感器響應信號ΔUe值為（13.7±1.08）μV，相對標準偏差為7.9%。對10 μg/LGB重復3次測定，傳感器響應信號ΔUe值為（5.0±0.35） μV，相對標準偏差為7.0%，傳感器重現性較好。

根據建立的理論模型，對檢測VX和GB的實際結果數據進行非線性回歸分析，結果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實測數據進行擬合，相關系數R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關系數R呈現出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應時間縮短，平衡響應電壓增大，與實際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實際檢測數據分析，對出現的噪聲及非特異性信號進行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性

4結論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學分析的新方法，克服了傳統膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應動力學模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學過程。根據擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近。此模型可用于實際檢測數據的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據。此傳感器操作簡單、響應快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進行預處理，在神經性毒劑現場快速檢測方面具有較好應用前景。

References

1Debouit C， Bazire A， Lallement G， Daveloose D. J. Chromatogr. B， 2010， 878： 3059-3066

2Subramaniam R， Astot C， Juhlin L， Nilsson C， Ostin A. J. Chromatogr. A， 2012， 1229： 86-94

3Tuovinen K， Paakkanen H， Hanninen O. Anal. Chim. Acta， 2001， 440： 151-159

4LI YuanGuang， ZHOU YongXin， FENG JianLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2000， 28（1）： 95-98

李元光， 周永新， 馮建林. 分析化學， 2000， 28（1）： 95-98

5WANG Kun， TAO ZhanHui， XU Lei， LIU YaQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（2）： 298-304

王 昆， 陶占輝， 徐 蕾， 劉亞青. 分析化學， 2014， 42（2）： 298-304

6SHEN Rui， TANG JiJun， ZHANG ChaoYang， GUO Lei， XIE JianWei. Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（4）： 701-705

申 睿， 唐吉軍， 張朝陽， 郭 磊， 謝劍煒. 高等學校化學學報， 2009， 30（4）： 701-705

7Seo H， Jung S， Jeon S. Sensors and Actuators B， 2007， 126（2）： 522-526

8Wee K W， Kang G Y， Park J， Kang J Y， Yoon D S， Park J H， Kim T S. Biosens. Bioelectron.， 2005， 20（10）： 1932-1938

9Yang S M， Chang C， Yin T I， Kuo P L. Sensors and Actuators B， 2008， 130（2）： 674-681

10ZHOU TingChong. Receptor Biochemical Pharmacology. Beijing： People′s Medical Publishing House， 1985： 104-108

周廷沖. 受體生化藥理學. 北京： 人民衛生出版社， 1985： 104-108

11Doll J C， Park S J， Pruitt B L. J. Appl. Phys.， 2009， 106： 064310006431012

12LIU ZhiWei， TONG ZhaoYang， MU XiHui， LIU Bing， HAO LanQun， ZHANG JinPing. Transducer and Microsystem Technologies， 2014， 33（3）： 8-11

劉志偉， 童朝陽， 穆晞惠， 劉 冰， 郝蘭群， 張金平. 傳感器與微系統， 2014， 33（3）： 8-11

AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis

根據建立的理論模型，對檢測VX和GB的實際結果數據進行非線性回歸分析，結果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實測數據進行擬合，相關系數R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關系數R呈現出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應時間縮短，平衡響應電壓增大，與實際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實際檢測數據分析，對出現的噪聲及非特異性信號進行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性

4結論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學分析的新方法，克服了傳統膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應動力學模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學過程。根據擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近。此模型可用于實際檢測數據的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據。此傳感器操作簡單、響應快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進行預處理，在神經性毒劑現場快速檢測方面具有較好應用前景。

References

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AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis

根據建立的理論模型，對檢測VX和GB的實際結果數據進行非線性回歸分析，結果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實測數據進行擬合，相關系數R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關系數R呈現出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應時間縮短，平衡響應電壓增大，與實際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實際檢測數據分析，對出現的噪聲及非特異性信號進行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性

4結論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學分析的新方法，克服了傳統膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應動力學模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學過程。根據擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應達到平衡的響應電壓（ΔUe）、響應時間（t0）均與實測值非常接近。此模型可用于實際檢測數據的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數據處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據。此傳感器操作簡單、響應快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進行預處理，在神經性毒劑現場快速檢測方面具有較好應用前景。

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AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis