南充市污水微生物絮凝劑產生菌的篩選及特性的研究

彭蘭慧，何革生，黃蓋群；高 輝

1.南充市嘉陵區環境監測站，四川南充，637005;2.南充市嘉陵區環境保護局，四川南充，637005;3.四川省農業科學院蠶業研究所，四川南充，637000；4.西華師范大學生命科學學院，四川南充，637002

南充市污水微生物絮凝劑產生菌的篩選及特性的研究

彭蘭慧1，何革生2，黃蓋群3；高 輝4

1.南充市嘉陵區環境監測站，四川南充，637005;2.南充市嘉陵區環境保護局，四川南充，637005;3.四川省農業科學院蠶業研究所，四川南充，637000；4.西華師范大學生命科學學院，四川南充，637002

從南充市嘉東污水處理廠活性污泥中分離出一株絮凝活性較高、絮凝劑產量較好的菌株(A3)，通過生理生化分析及16S rDNA序列鑒定該菌株為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。對A3生長特性進行了研究，結果表明：A3菌株的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素。在室溫下，pH值為10.0時,A3菌株絮凝力最高為94.70%；最適的金屬離子、發酵液添量、發酵溫度分別為Ca2+、2 mL、30℃。

微生物絮凝劑；生長特性；絮凝特性

當前，隨著人類社會的發展，水污染越來越嚴重。為保證水資源的可持續利用，必須解決水污染問題，人類在水處理方面做了大量工作，開發出多種水處理方法，如絮凝沉淀法、生化法、離子交換法、吸附法、化學氧化法、電滲析法和生態處理法等。在絮凝沉淀法中，絮凝劑起著非常重要的作用[1]。絮凝劑可分為有機高分子絮凝劑、無機絮凝劑、微生物絮凝劑。其中，微生物合成的具有絮凝能力的生物大分子，不僅具有傳統絮凝劑的優點，更具有傳統絮凝劑所沒有的優點，因此有關微生物絮凝劑方面的研究越來越受國內外的關注[2]。隨著人們對微生物絮凝劑研究的不斷深入，微生物絮凝劑在水處理方面的應用范圍也越來越廣。微生物絮凝劑不僅具有高效、無毒、無污染和使用條件粗放等特點，而且產生菌來源廣泛，種類多，是極具有開發價值的水處理劑。本研究從污水活性土壤中分離得到一株絮凝活性較高、絮凝劑產量較好的菌株，并對其絮凝劑的產生條件和絮凝條件以及菌株在不同培養條件和絮凝條件下對高嶺土懸浮液的絮凝效果進行研究，為進一步研究微生物絮凝劑的絮凝機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料1.1.1 菌種來源

實驗菌種來源于南充市嘉東污水處理廠的活性污泥。

1.1.2 培養基

(1)富集及篩選培養基 細菌培養基(LB)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20 min。細菌培養基(LA)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20min。

(2)發酵用培養基 葡萄糖20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

(3)碳源測試培養基 碳源20.0g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.1 g/L，(NH4)2SO40.2 g/L，脲 0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO40.2 g/L，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

供測試的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油、乙醇、淀粉。

(4)氮源測試培養基 葡萄糖20.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，NaCl 0.1 g/L，氮源1.5 g/L，MgSO40.2 g/L，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

供測試的氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、硝酸鉀、碳酸銨、硫酸銨、硝酸銨。

1.1.3 主要實驗儀器與設備

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速離心機、恒溫培養箱、恒溫水浴搖床、分光光度計、冰箱、分析天平。

1.2 菌株的篩選與分離鑒定

1.2.1 菌種的富集

取活性污泥約10.0 g，加入無菌水100 mL，搖勻后靜置15 min，取上清液1 mL加入到富集培養基，30℃、150 r/min培養48 h后,取1 mL培養液轉接到新的富集培養基中,相同條件下培養48 h，再重復一次。

1.2.2 菌種的分離

用無菌吸管吸取富集培養液1 mL，移入盛有9 mL無菌水的試管中，制成10-1稀釋液，再用無菌吸管吸取10-1稀釋液1 mL，移入另一盛有9 mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液，以此類推,分別制成10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。然后，用無菌吸管吸取0.1 mL10-4、10-5、10-6稀釋度的菌液，接種到LA分離培養基上，用無菌玻璃涂布棒進行涂布，每個稀釋度做5個平行樣，最后放到30℃恒溫培養箱中培養1～2 d，觀察LA培養基上微生物的生長情況。最后，選取生長良好、表面光滑且帶粘性的細菌單菌落，轉接到LA斜面培養基上于培養箱中30℃培養24 h后，放于4℃冰箱中保存，用于進一步篩選。

1.2.3 初篩

將分離獲得的菌株分別接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，置于搖床中于30℃、150r/min培養72 h，分別取相同量發酵液加入高嶺土懸浮液，目測各菌株發酵液對高嶺土懸液絮凝效果情況，記錄下絮凝沉淀顆粒大小和上清液比較清澈的菌株。

1.2.4 復篩

將初篩獲得的菌株接種到裝有50 mL滅菌發酵培養基的250 mL三角瓶中，在30℃、150r/min條件下培養72 h，將所得發酵液進行絮凝活性測定。

1.2.5 菌株的鑒定

對篩選出絮凝活性最高的菌株，根據菌落特征，進行初步鑒定；然后，再進行分子生物學鑒定，按照傳統提取細菌基因組DNA[3]方法，選擇16S rDNA基因通用引物序列分別為：(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環。將PCR擴增產物用試劑盒純化，送上海捷瑞生物工程有限公司測序。

1.2.6 絮凝率的測定方法

參照文獻[4]的方法進行。

1.3 培養條件的優化

分別改變發酵培養基中碳源、氮源的種類，取48 h發酵液2 mL處理含有0.2 g高嶺土100 mL懸濁液，對培養條件進行優化[5]。

1.4 細菌絮凝劑絮凝效果

選擇pH值、不同金屬離子、發酵液添加量、溫度4個主要影響因素，對1.1.3中的高嶺土懸濁液進行絮凝處理[6]。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

經3次連續富集培養，得到了樣品的混濁培養液，表明樣品中的微生物在富集培養基上可以大量繁殖。利用稀釋平板法對富集培養液中的微生物進行分離，結果得到8株優勢菌株。根據培養基上生長的菌株的菌落形態、顏色、大小等特征，對它們進行初步分類。將這8株菌作為初步篩選的對象，并分別編號為A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2。經初篩，A1、A2、A4、B1、B2、C1、C2產生絮凝塊小，速度慢；A3絮凝時絮凝塊較大且沉降速度快，絮凝效果比較好。從初篩得到的8株菌株中獲得1株絮凝活性較好的絮凝劑產生菌A3，絮凝率是94.70%(表1)。將A3接種到發酵培養基中于30℃、150 r/min培養72 h。A3接種8 h，發酵液開始變渾濁，12 h后濁度明顯增加，28 h后發酵液開始有少量氣泡，隨著培養時間的增加，氣泡量也增加。

表1 產生絮凝劑菌株的篩選結果

2.2 菌株的觀察與鑒定

對篩選出的優勢菌株A3進行分離、鑒定，菌株呈桿狀，革蘭氏陰性菌，有橢圓形芽孢。菌落形態規則，表面濕潤、凸起，菌體為乳白色且不透明。獲得的菌株A3 16S rDNA擴增片段為1 467 bp，測序結果表明，該序列與根瘤土壤桿菌16S rDNA序列有較高的同源性(99.78%)，結合形態學和生理生化特征鑒定其為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。

2.3 培養條件的優化

2.3.1 碳源對絮凝活性的影響

選取葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乙醇、甘油作為A3菌株的碳源，測定其生長量，結果表明(圖1)，A3菌株對碳源的利用存在差異，其中以淀粉作為碳源細菌的生長量最高，達0.144 g，但長勢不好。以蔗糖、麥芽糖作為碳源，細菌生長量分別為0.135 g、0.118 g，且比較好，說明蔗糖、麥芽糖最適合作為A3菌株的碳源。從圖1還可看出，乙醇、甘油作為碳源添加，細菌生長量僅為0.078 g、0.095 g，且細菌長勢不好，故不宜作為A3的碳源。

圖1 不同碳源對絮凝活性的影響

圖2 不同碳源對絮凝活性的影響

2.3.2 氮源對絮凝活性的影響

選取蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、甘氨酸、硝酸鉀、碳酸銨、硫酸銨、硝酸銨作為A3菌株的氮源，測定其生長量，結果表明(圖2)，A3對氮源的利用存在差異，尿素、硫酸銨、碳酸銨作為氮源添加對菌株生長有利，菌體生長量分別為0.112 g、0.109 g、0.091 g,其中對尿素的利用最好,較適宜作為氮源添加。甘氨酸作為氮源添加效果最差，菌體生長重量僅為0.015 g,而且菌株生長情況較差，不適宜作為A3菌株的氮源。

2.4 絮凝條件優化

2.4.1 pH對A3發酵液絮凝率的影響

在其他條件不變的情況下，培養基pH值分別調為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，實驗結果表明(圖3)，在pH值為8.0～12.0范圍內菌體絮凝率較高，pH值為10.0時絮凝率最高，達到91.42%；pH在10.0以上，隨著pH值的升高絮凝率反而下降，表明強堿性抑制微生物絮凝活性物質的分泌；在pH值為10.0時達到最大，表明適當的堿性條件下有利于微生物的生長。由圖4可見，在pH值為6.0～7.0的酸性條件下，絮凝作用較弱，而且隨著酸性的減弱，尤其當pH值超過7.0時，絮凝活性迅速升高，并基本維持在71%以上。因此，該微生物絮凝劑適宜的pH值范圍為8.0～12.0，其中pH值為10.0時最佳。

圖3 pH值對絮凝活性的影響

2.4.2 金屬離子對A3發酵液絮凝率的影響

在培養基中分別加入2mL 0.5g/L的Mg2+、Ca2+、Na2+、Fe2+、K2+、Al3+、Cu2+等不同的金屬離子，實驗結果顯示(圖4)，未加任何金屬離子的空白實驗的絮凝效果最差，絮凝率僅為25.30%；但添加不同的金屬離子對絮凝活性有不同的作用，其中Al3+、Cu2+對懸濁液的絮凝作用不大，絮凝率僅為43.4%、37.1%；其他的金屬離子均有明顯的助凝效果，其中以Ca2+的助凝效果最好，絮凝率達93.6%。

圖4 不同金屬離子對絮凝活性的影響

圖5 不同發酵液添加量對絮凝活性的影響

2.4.3 發酵液添加量對A3發酵液絮凝率的影響

設5個發酵液添加量梯度：1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，實驗結果表明(圖5)，在低濃度范圍內，隨著發酵液添加量的增加，絮凝率隨之提高；在2 mL添加量時，絮凝率達到最高值84.9%；但隨著濃度的再增加，所形成的絮凝體會重新變成穩定膠體，絮凝率反而不斷下降，因此確定最佳的發酵液添加量為2 mL。

2.4.4 不同溫度對A3發酵液絮凝率的影響

實驗共設5個溫度梯度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，結果表明(圖6)，菌株A3在20℃～30℃時,絮凝劑絮凝率隨著溫度的升高而增加，在30℃時絮凝率達到最大值87.7%；但在30℃～40℃時，絮凝劑絮凝率隨著溫度的升高而逐漸降低，在40℃時絮凝率降到55.4%。由此得出最佳培養溫度為30℃，該溫度和細菌的最佳生長溫度一致。

圖6 不同溫度對絮凝活性的影響

3 結論與討論

本實驗從南充市嘉東污水處理廠的活性污泥中獲得了8株具有絮凝效果的菌株，且快速分離了1株產絮凝劑的微生物,菌株標號為A3，絮凝率為94.70%。通過對獲得的菌株A3 16S rDNA擴增片段為1 467 bp，測序結果表明該序列與根瘤土壤桿菌16S rDNA序列有較高的同源性，為99.78%，結合生理生化分析及16S rDNA序列鑒定該菌株為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。采用單因素法研究培養基中碳源、氮源對其絮凝活性的影響，并對A3菌株進行優化培養。初步確定A3菌株生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素；培養基應調成堿性，pH值為10.0時A3菌株絮凝率為94.70%。最終確定pH值最適范圍為8.0～12.0，其中pH值為10.0時絮凝效果最佳；培養基添加金屬離子均有明顯的助凝效果，其中以Ca2+的助凝效果最好，絮凝率可達93.6%；最佳的發酵液添加量為2 mL；最佳培養溫度為30℃。本研究獲得的高效微生物絮凝劑能否適合其他不同條件的污水環境，還需要作進一步的實驗研究。在今后的研究中將對篩選出的優勢菌株進行遺傳改造，大幅度提高微生物的降解能力，以適應不同的廢水處理要求，從而降低污水處理成本，提高處理效率。

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(責任編輯：汪材印)

2014-05-12

彭蘭慧(1983-)，女，四川隆昌人，助理工程師，主要研究方向：環境工程及環境監測。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.09.028

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A

1673-2006(2014)09-0090-04