姜黃素對氧化型低密度脂蛋白誘導的大鼠血管平滑肌細胞單核細胞趨化蛋白—1表達、細胞增殖和凋亡的影響

李濤 馮愛橋

[摘要] 目的 探討姜黃素對大鼠血管平滑肌細胞單核細胞趨化蛋白-1表達、增殖和凋亡的影響。 方法 分離SD大鼠血管平滑肌細胞進行培養傳代，采用不同濃度的姜黃素作用于氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）誘導的大鼠平滑肌細胞，根據作用藥物濃度進行分組，對照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 20 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 40 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組。分析姜黃素對大鼠血管平滑肌細胞單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達、對細胞的增殖的影響。按照加入藥物濃度進行分組，對照組（不加任何藥物），姜黃素50 μmol/L組，姜黃素100 μmol/L組，姜黃素120 μmol/L組，分析姜黃素對細胞凋亡的影響。 結果 Ox-LDL 100 μg/mL組MCP-1分泌[（812.6±78.7）ng/L]及MCP-1 mRNA表達水平[（1.18±0.11）]較對照組[（91.3±6.1）ng/L，（0.16±0.04）]顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。姜黃素對Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達、細胞增殖具有顯著的抑制作用，對細胞凋亡有誘導作用，并且隨著姜黃素濃度的增加，作用越明顯（P < 0.01）。 結論 姜黃素能夠抑制Ox-LDL誘導的大鼠細胞平滑肌細胞MCP-1表達以及細胞增殖，誘導大鼠細胞平滑肌細胞凋亡。

[關鍵詞] 姜黃素；大鼠；血管平滑肌細胞；單核細胞趨化蛋白-1

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）07（c）-0008-05

冠心病是臨床常見病，近年來，隨著人們飲食結構的變化以及生活工作節奏的增快，冠心病的發生率呈上升趨勢。動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎，而平滑肌增生、遷移參與了冠狀動脈粥樣硬化的整個過程。氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）能夠促進動脈粥樣硬化的發生和發展[1-2]。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）具有活化和趨化單核/巨噬細胞的作用，單核細胞在MCP-1的趨化作用下，聚集在血管內膜下，吞噬脂質、形成泡沫細胞[3-4]。姜黃素是一種從姜黃、莪術等植物中提取的成分，具有抗炎、抗氧化、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等作用[5]。本研究分析姜黃素對Ox-LDL誘導大鼠平滑肌細胞MCP-1的表達情況以及平滑肌細胞增殖和凋亡的影響。現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠，體重250～300 g，周齡2～5周，購于常州卡文斯實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 姜黃素（長沙華錦生物科技有限公司），大鼠MCP-1 ELISA試劑盒（上海凱博生化試劑有限公司），Western-blot化學發光試劑盒（貝博生物），總DNA提取盒（廣州健侖生物科技有限公司），逆轉錄試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司），PCR擴增試劑盒（上海生工生物科技有限公司）。二氧化碳培養箱（無錫精創科技有限公司），凝膠成像分析系統（法國Vilber），低溫冷凍高速離心機（德國Hettich），蛋白電泳儀（日本ATTO株式會社公司），基因擴增儀（上海西樸生物科技有限公司），多功能酶標儀（美國BioTek公司）。

1.1.3 主要試劑配制 姜黃素溶液：姜黃素粉末溶于二甲基椏楓，配成的原液濃度為50 mmol/L，低溫保存，需要時配制成需要的濃度。PBS平衡鹽溶液配制：8 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，磷酸氫鈉2.9 g，磷酸氫鉀0.2 g加蒸餾水，陪成1 L，調整pH值7.3～7.5，分裝，低溫保存。培養基：DMEM干粉加去離子水溶解，定容1000 mL，加雙抗，調節pH為7.0，過濾除菌后分裝，4℃保存。MTT（噻唑藍）工作液：MTT溶于PBS液中，配制濃度為5 mg/mL，過濾除菌，4℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠原代主動脈平滑肌細胞培養傳代 SD大鼠處死后分離大鼠主動脈，在青霉素無血清DMEM中漂洗3～4次，分離中膜層，DMEM培養基清洗3次，放入培養皿，加胎牛血清。剪碎中膜層，放入培養瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基，翻轉培養瓶，使組織塊貼壁，放入培養箱中，37℃，5%CO2，培養3h。翻轉培養瓶，次日觀察無污染，繼續培養5～7天，見原代血管平滑肌細胞。當細胞覆蓋率達到80%～90%，細胞單層融合，進行消化傳代。每2天換1次液。傳至2～3代凍存。

1.2.2 姜黃素對Ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞（VSMCs）MCP-1分泌的影響研究方法 取出平滑肌細胞進行解凍、培養并傳代，取傳3～8代細胞，通過免疫組化法鑒定為血管平滑肌細胞用于實驗。根據作用藥物及濃度不同進行分組。對照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素5 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素10 μmol/L組，Ox-LDL 100μg/mL+姜黃素30 μmol/L組。采用ELISA和RT-PCR檢測細胞上清中MCP-1的濃度以及細胞MCP-1 mRNA的表達情況。

1.2.3 姜黃素對Ox-LDL誘導大鼠VSMCs增殖的影響研究方法 凍存細胞解凍，培養，傳代，鑒定為平滑肌細胞。根據作用藥物濃度進行分組，對照組（不加任何藥物），Ox-LDL 100 μg/mL組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組。采用MTT法檢測OD值測定細胞增殖程度。

1.2.4 姜黃素對VSMCs誘導凋亡作用的研究方法 取凍存細胞解凍，培養傳代，鑒定為平滑肌細胞。按照加入藥物濃度進行分組，對照組（不加任何藥物）姜黃素50 μmol/L組，姜黃素100 μmol/L組，姜黃素120 μmol/L組，檢測細胞凋亡情況，采用Western-blot方法檢測細胞caspase-8p10表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件數據處理，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對Ox-LDL誘導VSMCs MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達的影響

Ox-LDL 100 μg/mL組MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達水平較對照組顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素10 μmol/L組和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素30 μmol/L組MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表達水平較Ox-LDL 100 μg/mL組顯著下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 30 μmol/L組MCP-1分泌水平又顯著低于Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素5 μmol/L組和Ox-LDL 100μg/mL+姜黃素10 μmol/L組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 姜黃素對Ox-LDL誘導的VSMCs增殖影響

對照組OD值為（0.326±0.039），見圖1。Ox-LDL 100 μg/mL組OD值為（0.548±0.074），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L組OD值為（0.522±0.072），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組OD值為（0.442±0.061），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組OD值為（0.379±0.066）。各組之間比較，差異有高度統計學意義（F = 12.977，P < 0.01）。其中Ox-LDL 100 μg/mL組OD值顯著高于對照組，而Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素40 μmol/L組OD值和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素80 μmol/L組OD值較Ox-LDL 100 μg/mL組OD值顯著下降，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。

A組：Ox-LDL 100 μg/mL組；B組：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素20 μmol/L 組；C組為Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 40 μmol/ L 組；D組：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黃素 80 μmol/ L 組；與對照組比較，*P < 0.01；與A組比較，△P < 0.01；Ox-LDL：氧化型低密度脂蛋白

2.3 姜黃素對大鼠平滑肌細胞凋亡及caspase-8p10表達的影響

姜黃素50 μmol/L組、姜黃素100 μmol/L組、姜黃素120 μmol/L組大鼠平滑肌細胞凋亡率、caspase-8 p10表達較對照組顯著升高，姜黃素100 μmol/L組和姜黃素120 μmol/L組顯著高于姜黃素50 μmol/L組，而姜黃素120 μmol/L組又顯著高于姜黃素100 μmol/L組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。提示隨著姜黃素濃度的升高，凋亡率及caspase-8p10表達升高越明顯。

3 討論

冠心病是中國首要的致死原因，由冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致。冠狀動脈粥樣硬化，導致管腔狹窄、板塊破裂是導致冠心病的病理基礎。大量研究顯示血管平滑肌在動脈粥樣硬化的發生和發展中發揮了重要的作用。動脈粥樣硬化的板塊中存在來自血液的炎性細胞、免疫細胞、中性粒細胞，還包括來自血管壁的內皮細胞以及血管平滑肌細胞等[6]。血管內皮功能障礙，促進細胞和脂質的滲透，脂質蛋白氧化，血管平滑肌細胞增殖，血小板活化，血栓形成，導致粥樣硬化的啟動。細胞因子在動脈粥樣硬化的發生和發展過程中也發揮重要的作用，TF是凝血級聯反應中重要的啟動子，TF抗原、TFmRNA存在于多種細胞中，包括血管平滑肌細胞、內皮細胞等[7]。環氧化酶-2在動脈粥樣硬化組織中的表達顯著升高，特別表達于炎性巨細胞以及中層VSMCs中[8]。

低密度脂蛋白膽固醇（LDL）是血漿膽固醇主要的轉運體。Ox-LDL是氧化修飾的低密度脂蛋白，被認為是動脈粥樣硬化關鍵的啟動因素[9]。LDL中不飽和脂肪酸中的脂質分子被氧化，產生大量的脂質氧化物，脂質氧化產物共價修飾apoB蛋白，產生乙醛類復合物，這些乙醛類的復合物進一步氧化修飾脂蛋白氨基酸殘基，生成各種加合物，最終形成Ox-LDL[10-11]。Ox-LDL是一類經化學修飾的脂蛋白顆粒的混合物，而不是單一成分。LDL氧化修飾機制包括金屬離子氧化法，髓過氧化物酶氧化作用，糖化LDL，一氧化氮及其氧化機制。在動脈粥樣硬化劑血管性疾病的發病機制中，Ox-LDL必不可少。Ox-LDL可引起細胞內皮細胞結構和功能的變化，從而導致內皮細胞變性、壞死、脫落，導致血管內皮完整性遭到破壞[12]。單核細胞以及LDL通過血管內皮進入內膜下，形成脂質條紋。Ox-LDL還能刺激單核細胞、內皮細胞、巨噬細胞等分泌大量的言行因子、黏附因子、趨化因子，促使單核細胞核內皮細胞分化為巨噬細胞。遺傳性高脂血癥兔模型血漿Ox-LDL水平顯著升高，抗氧化劑能夠降低Ox-LDL水平，減輕動脈粥樣硬化的進程。心絞痛患者血液中Ox-LDL水平顯著升高，外周血NF-κB活性升高，而在體外培養的單核細胞中加入Ox-LDL，能夠顯著增加NF-κB活性，這提示Ox-LDL能增加NF-κB活性，從而增加患者的氧化應激反應[13-14]。重組人IgG1抗體是針對Ox-LDL表位DNA修飾的apoB-100表位的抗體，研究證明其能顯著降低小鼠血液中Ox-LDL水平，說明Ox-LDL抗體在降低血液中Ox-LDL水平，從而阻止動脈粥樣硬化進程而發揮作用。

細胞趨化蛋白是一個蛋白質家族，由十余種結構有較大同源性、分子量多為8～10 kD的蛋白組成。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是β亞家族的代表，可趨化單核細胞。由內皮細胞、血管平滑肌細胞等產生。MCP-1提高VSMC中MCPIP1 mRNA水平，并呈劑量和時間依賴性地上調MCPIP1蛋白表達[15]。和MCP-1處理的VSMC相比，MCPIP1基因沉默后VSMC的細胞數量、細胞活力及細胞DNA合成率均明顯降低，S期細胞數量下降；MCPIP1基因沉默可抑制MCP-1或PDGF對c-fos mRNA的上調作用。單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白通過介導單核細胞趨化蛋白-1誘導的血管平滑肌細胞的增殖[16]。MCP-1基因-2518A/G多態性與心肌梗死易感性具有密切的相關性[17]。

姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學成分，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。姜黃為常用中藥，其主要生物活性成分為姜黃素類和揮發油。前者具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌等作用；而后者主要起抗炎、抗菌以及止咳作用[18-20]。姜黃素具有誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、抑制腫瘤細胞生長等作用，從而發揮抗癌作用。姜黃素對心血管疾病、關節炎、關節腫大等也具有臨床療效[18-22]。姜黃素能夠調節血脂水平，抑制細胞增殖，抗脂質過氧化，抑制脂質斑塊的形成，抗炎、抗凝血，抑制心肌重構等。姜黃素能夠抑制人冠狀動脈內皮細胞膜表面血栓調節蛋白和內皮細胞活化蛋白的表達，還能夠抑制TNF-α介導的人冠狀動脈內皮細胞膜表面TM、EPCR mRNA的表達，從而達到抑制和減少血栓形成的作用。

既往研究顯示Ox-LDL能夠促進血管平滑肌細胞MCP-1的分泌而參與動脈粥樣硬化的發生。在本研究中，Ox-LDL作用的大鼠血管平滑肌細胞MCP-1的分泌顯著增加，并且MCP mRNA的表達也顯著增加，這與既往的研究結果一致。而姜黃素具有抑制Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞MCP-1的分泌以及MCP mRNA的表達，并且這種抑制作用隨著姜黃素弄高度的升高，作用越強。Ox-LDL能夠顯著誘導大鼠血管平滑肌細胞的增殖，而血管平滑肌細胞的增殖、遷徙與動脈粥樣硬化的發生關系密切。在本次研究中，姜黃素對Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，并且隨著姜黃素弄得的升高，抑制作用越明顯，說明這樣的抑制作用具有濃度依賴性。平滑肌細胞凋亡不足時動脈粥樣硬化早期進展的主要因素，因此誘導平滑肌細胞凋亡可能會成為防治動脈粥樣硬化的方法之一。在本研究中，姜黃素對大鼠血管平滑肌細胞具有顯著的誘導凋亡作用，并且隨著濃度的升高，這樣的誘導作用也逐漸增強，說明姜黃素誘導大鼠血管平滑肌細胞凋亡具有濃度依賴性。Caspase-8是凋亡的啟示因子，能夠啟動細胞凋亡的細胞外途徑和細胞內途徑。在本研究中，姜黃素能夠顯著上調Caspase-8的表達，這可能是其誘導細胞凋亡的主要機制。

綜上所述，Ox-LDL能夠上調大鼠血管平滑肌細胞MCP-1的表達以及MCP mRNA的表達，誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖，姜黃素對Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞MCP-1、MCP mRNA的表達，以及細胞增殖具有抑制作用，且能誘導大鼠血管平滑肌細胞凋亡。

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（收稿日期：2014-03-31 本文編輯：蘇 暢）