正常早孕與稽留流產絨毛組織結構中Bax和Bcl-2蛋白表達的對比研究

楊興爽

正常早孕與稽留流產絨毛組織結構中Bax和Bcl-2蛋白表達的對比研究

楊興爽

目的 研究凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax在正常早孕與稽留流產絨毛組織結構中的表達及其意義, 探討稽留流產原因。方法 選擇本院就診的稽留流產患者和早孕人工流產患者各60例, 分為A組、B組。流產后立即留取胚胎絨毛組織送病理。分別應用光鏡觀察各組絨毛組織細胞形態結構的改變；同時應用免疫組織化學方法和計算機圖文分析系統檢測Bax、Bcl-2在各組絨毛的表達及細胞凋亡情況。結果 稽留流產組絨毛滋養細胞中凋亡指數為(33.32±0.79)%, 明顯高于對照組B組的(18.90±0.63)%,差異有統計學意義(P＜0.01)。Bax和Bcl-2在兩組合體滋養細胞中的陽性率比較顯示, 稽留流產組中Bax陽性率增高, Bcl-2陽性率下降, Bcl-2/Bax比值降低, 差異均有統計學意義(P＜0.01)。結論 蛻膜絨毛中Bax陽性率增高和Bcl-2陽性率下降可使絨毛合體滋養細胞凋亡明顯增加, 并進一步導致稽留流產發生。

Bax蛋白；Bcl-2蛋白；胎盤絨毛；稽留流產；免疫組織化學

稽留流產又稱過期流產, 是由于早期妊娠失敗導致孕卵死亡的一種常見疾病, 發病率高。目前認為可能的病因有：胚胎染色體異常、母體嚴重感染、生殖器官異常、內分泌異常、免疫功能異常、不良環境因素等。其確定的機制仍然不清。由于病因尚不明確, 無有效的對癥預防治療方法, 給很多患者帶來了很大的痛苦, 也給臨床醫師帶來了很大的困惑。細胞凋亡相關基因Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B型白細胞/2型淋巴細胞樣蛋白( Bcl-2) 是與細胞凋亡有關的基因,也是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族。目前國內外對其在很多組織中的表達有所研究, 但對稽留流產絨毛組織中的表達目前國內尚未見報道。對正常早孕與稽留流產絨毛組織結構中Bax、Bcl-2的表達進行對比研究, 探討兩者之間的異同點及Bax/Bcl-2的平衡對維持正常妊娠的作用, 研究稽留流產絨毛組織結構中Bax、Bcl-2的表達是否異常, 了解是否其表達異常是稽留流產原因之一, 可以幫助尋找稽留流產病因,為最終找到預防稽留流產的突破口奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院就診的稽留流產患者和早孕人工流產患者各60例, 分為A組(稽留流產組)和對照組B組(人工流產組)。A組年齡24~36歲, 平均(27.31±3.58)歲, 妊娠時間(56±5) d；B組年齡21~37歲, 平均(27.43±3.83)歲,妊娠時間(55±4) d；其年齡、妊娠時間、孕產次數差異無統計學意義。均未放置宮內節育器, 流產前均未應用任何藥物,無發熱、急性炎癥等表現。均經B超確診宮內正常早孕或稽留流產。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 流產后立即留取肉眼可見的胚胎絨毛組織, 中性福爾馬林固定、制成病理切片。分別應用光鏡觀察各組絨毛組織細胞形態結構的改變；同時應用免疫組織化學方法和計算機圖文分析系統檢測Bax、Bcl-2在各組絨毛的表達及細胞凋亡情況。

1.2.2 方法 4 μm厚病理切片連續切片3張。一張用光鏡觀察各組絨毛組織細胞形態結構的改變, 兩張行免疫組化染色。采用SP法, 微波爐枸椽酸鹽抗原修復, DAB顯色。每批染色均設陽性和陰性對照, 嚴格按試劑盒推薦方法染色。每張切片觀察5個視野, 計算出每100個滋養細胞的凋亡率。

1.2.3 結果判定 Bcl-2和Bax陽性反應均為胞漿、胞膜著棕黃色顆粒。細胞無黃色顆粒為陰性(-), 陽性細胞數在5%~25%為弱陽性(+),陽性細胞數在25%~50%之間為陽性(++), 陽性細胞數在50%~75%之間為陽性(+++), >75%為強陽性(++++)。

1.2.4 統計學方法 運用SPSS13.0軟件進行統計學分析。所得數據以均數±標準差(s) 表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡結果 自然流產組絨毛組織結構清晰, 外層為合體滋養細胞, 內層為細胞滋養細胞, 排列緊密, 稽留流產組中的絨毛滋養層細胞變性、壞死, 甚至脫落, 間質擴張水腫,細胞分散, 血管擴張, 并可見炎性細胞浸潤。兩組滋養細胞凋亡指數比較,稽留流產組絨毛合體滋養細胞中凋亡指數與對照組比較顯著增加, 差異有統計學意義(P＜0.01), 結果見表1。

表1 兩組滋養細胞凋亡指數比較(%)

2.2 免疫組化結果 Bax在蛻膜絨毛中的陽性表達主要位于合體滋養細胞和細胞滋養細胞的胞漿中, Bcl-2主要分布于絨毛合體滋養層的胞質內。兩組滋養細胞Bcl-2、Bax陽性率及Bcl-2/Bax比值比較, 稽留流產組合體滋養細胞中Bcl-2陽性率較對照組低, 而Bax陽性率較對照組高, Bcl-2/Bax比值降低, 差異均有統計學意義(P＜0.01), 結果見表2。

表2 兩組滋養細胞Bax、Bcl-2陽性率及Bcl-2/Bax比值比較

3 討論

胎盤是維持胚胎及胎兒在子宮內營養發育的重要器官。胎盤通過蛻膜細胞和滋養細胞的增殖與凋亡, 不斷進行組織結構的改善, 進而實現其功能的完善。胚泡植入、胎盤發育早期打破凋亡的調節可能直接或間接地影響妊娠的成敗［1］。賀子秋等［2］向鼠腹膜內注射人重組白介素-2致妊娠鼠流產,發現其絨毛滋養細胞中凋亡較正常妊娠鼠高。正常妊娠胎盤組織的凋亡和增殖處于一種平衡狀態, 這種平衡一旦被打破,發生異常凋亡, 將導致自然流產等病理妊娠的發生［3］。

稽留流產是妊娠早期最常見的并發癥之一, 病因復雜。具體在哪個環節導致了胚胎停止發育尚不清楚。作者通過光鏡觀察研究發現, 自然流產組, 也就是正常妊娠絨毛組織結構清晰, 外層為合體滋養細胞, 內層為細胞滋養細胞, 排列緊密, 而稽留流產組, 也就是胚胎停發后的絨毛滋養層細胞變性、壞死, 甚至脫落, 間質擴張水腫, 細胞分散, 血管擴張, 并可見炎性細胞浸潤。說明胎盤絨毛組織的變性壞死是導致胚胎死亡的主要原因。進一步通過免疫組織化學方法和計算機圖文分析系統檢測Bax、Bcl-2在兩組絨毛中的表達,發現兩組滋養細胞凋亡指數比較,稽留流產組絨毛合體滋養細胞中凋亡指數與對照組比較顯著增加, 差異有統計學意義(P＜0.01)。Bax在蛻膜絨毛中的陽性表達主要位于合體滋養細胞和細胞滋養細胞的胞漿中, Bcl-2主要分布于絨毛合體滋養層的胞質內。兩組滋養細胞Bcl-2、Bax陽性率及Bcl-2/ Bax比值比較, 稽留流產組合體滋養細胞中Bcl-2陽性率較對照組低, 而Bax陽性率較對照組高, Bcl-2/Bax比值降低,差異均有統計學意義(P＜0.01)。

Bcl-2基因家族是目前廣泛研究的一類細胞凋亡相關基因, 其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一。通過上調抗凋亡的Bcl-2的基因表達, 可以在轉錄水平調節凋亡相關蛋白的表達以影響凋亡的發生。Bax是從人B細胞中首次發現與Bcl-2共沉淀的另一類蛋白質, 它可以促進細胞凋亡,作用與Bcl-2相反。通過觀察Bcl-2和Bax在稽留流產與正常妊娠絨毛合體滋養細胞中的表達, 發現稽留流產組Bcl-2低于對照組, Bax則高于對照組。說明Bcl-2/Bax基因共同參與正常早孕期蛻膜細胞凋亡的調節, 且處于一種正常的平衡狀態。Bax增高則細胞凋亡增加, Bax降低則細胞凋亡降低。細胞凋亡調控異常會導致習慣性流產以及多種妊娠并發疾病的發生, 這與丁峰等［4］在自然流產蛻膜組織中觀察的結果相類似。本次研究結果顯示：稽留流產組與正常妊娠組相比, Bcl-2/Bax比值降低, 比例平衡被打破, 細胞凋亡增加, 導致稽留流產結局。

綜上所述, 正常早孕階段細胞凋亡和修復、Bcl-2/Bax在胎盤絨毛組織中的表達處于一種動態平衡狀態, 這種平衡對妊娠的順利進行有重要作用。如果細胞凋亡指數增加、Bcl-2/Bax在胎盤絨毛組織中的表達失衡則會導致稽留流產的發生。如果能夠進一步發現引起細胞異常凋亡的因素和機制, 發現導致Bcl-2/Bax在胎盤絨毛組織中的表達失衡的原因, 進而人為地控制這些因素或阻斷其作用途徑, 就能夠找到預防和治療復發性稽留流產的方法。

［1］ Dai D, Moulton BC, Oqle TF.Regression of the decidualized me sometrium and decidual cell apoptosis are associated with a shift in expression of Bcl-2 family members.Biol Reprod, 2000, 63(1):188-195.

［2］ 賀子秋,劉嵐,陶昱.自然流產絨毛與蛻膜組織中細胞凋亡的研究.同濟大學學報(醫學版), 2010,31(3):38-40.

［3］ Minas Jeschek U, Kalantaridou SN.Abortion is associated with increased expression of FasL in decidual leukocytes and apoPtosis of extravillous trophoblasts:a role for CRH and uroco~in.Mol Hum Reprod, 2007,13(9):663-673.

［4］ 丁峰,傅國強,邢福棋,等.自然流產中的早孕蛻膜細胞Bcl-2/ Bax比例異常.基礎醫學與臨床, 2002,22(4):363-366.

Comparative study of Bax, Bcl-2 protein expression in villi structure during normal pregnancy and missed abortion

YANG Xing-shuang.Linyi Yishui Central Hospital, Linyi 276400, China

Objective To study apoptosis regulating proteins Bcl-2 and Bax in normal pregnancy and missed abortion villi structure and its significance, and explore the reasons for missed abortion.Methods Choose our hospital patients missed abortion and early pregnancy abortion patients, 60 cases in total, divided into group A and group B.Immediately after abortion, embryonic villi specimens sent to pathology.Light microscopy were applied in each group villi morphological changes in the structure, while applying immunohistochemical methods and computer image analysis system to detect Bax, Bcl-2 expression in each group villi and cell apoptosis.Results Missed abortion group trophoblast cell apoptosis index was (33.32±0.79)%, was significantly higher in group B(18.90±0.63)%, difference was statistically significant (P<0.01).Bax and Bcl-2 in the two groups syncytiotrophoblast cells show positive rate.In missed abortion group, Bax positive rate increased, Bcl-2 positive rate of decline, Bcl-2/Bax ratio increased, differences were statistically significant (P<0.01).Conclusion The increasing positive expression rate of Bax and the decreasing positive expression rate of Bcl-2 in decidua villi can lead to villous syncytiotrophoblast cells increased significantly,and further lead to missed abortion.

Bax protein; Bcl-2 protein; Placental villi; Missed abortion;Immunohistochemistry

276400 山東省臨沂市沂水中心醫院