油橄欖葉中橄欖苦苷含量的HPLC-DAD測定分析

李春燕，唐遠(yuǎn)謀，梁曉玲，劉 嵬，顏 軍，茍小軍*

(1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；3.成都大學(xué)金牛校區(qū)管理委員會，四川 成都 610036)

油橄欖葉為木犀科、木犀欖屬四季常綠喬木油橄欖(OleaeuropaeaL.)的葉子[1]，其富含的抗氧化活性成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于橄欖油[2]，尤其以葉中橄欖苦苷為代表的抗氧化活性成分，其含量明顯高于果實(shí)和樹枝[3]。橄欖苦苷(oleuropein，OE)是一種重要的苯酚類裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化能力[4-5]，研究表明其能減慢低密度脂蛋白的氧化程度，可以預(yù)防冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化，還具有舒緩平滑肌和降低血壓等功效[6]。隨著對橄欖苦苷研究的深入，其藥理活性功能逐漸被研究人員發(fā)現(xiàn)并逐步應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品等行業(yè)。國外對橄欖苦苷的研究較早，Cristina 等[7]對橄欖苦苷及其相關(guān)化合物的產(chǎn)生、分布和它在植物體內(nèi)生物合成過程進(jìn)行了特征分析。王成章等[8]研究了引種的希臘阿斯品種橄欖葉中橄欖苦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分析方法及其季節(jié)性變化規(guī)律。彭煥超等[9]采用RP-HPLC法測定了不同來源油橄欖葉中的橄欖苦苷，但沒有對油橄欖葉中的橄欖苦苷做定性分析。為此，本研究擬通過HPLC-DAD對油橄欖葉中的橄欖苦苷做定性定量分析，并進(jìn)一步分析其穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

油橄欖葉(四川天源油橄欖公司提供)干燥粉碎后備用；40%的橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈(色譜純)、甲醇，均購自成都科龍化工有限公司。

1.1.2 儀器

微型高速萬能試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KQ3200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；日立L-2000高效液相色譜儀、二極管陣檢列測器(日立儀器設(shè)備公司)；FA10004B分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

按照王成章等[10]的實(shí)驗(yàn)方法并作適當(dāng)改進(jìn)：色譜柱為Akasil C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為23%乙腈水溶液，檢測波長為230 nm，柱溫為35 ℃，流速為1 mL/min。

1.2.2 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取40%的橄欖苦苷對照品10. 0 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為23%的乙腈-水溶液溶解并定容，搖勻后，配成橄欖苦苷質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的溶液。

1.2.3 油橄欖葉提取液的制備

取自然陰干的油橄欖，粉碎。精確稱取油橄欖葉粉末1 g，置于100 mL錐形瓶中，加入70%的甲醇溶液30 mL，常溫下，于超聲波中提取30 min。提取完全后，過濾，備用。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.2.2配制的橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液按對半稀釋法，依次配成0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg /mL的溶液。按質(zhì)量濃度由小到大分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣60 μL，每個(gè)體積重復(fù)進(jìn)樣3次，取其HPLC峰面積平均值。記錄保留時(shí)間和峰面積，以HPLC峰面積為縱坐標(biāo)，橄欖苦苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，得HPLC線性回歸方程。

1.2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1.2.3制備的油橄欖葉提取液，每次進(jìn)樣60 μL，每隔1 h進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄其保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取1.2.3制備的油橄欖葉提取液，每次進(jìn)樣60 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄其保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取1.2.3制備的油橄欖葉提取液5 mL，共5份，各加入0.05 g 40%的橄欖苦苷，搖勻后，用0.45 μm濾頭過濾，進(jìn)HPLC分析，記錄保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.4.5 樣品中橄欖苦苷含量的測定

將1.2.3制備的油橄欖葉提取液經(jīng)0.45 μm濾頭過濾，進(jìn)樣量為60 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，取其峰面積的平均值。用面積歸一法，根據(jù)橄欖苦苷的線性回歸方程計(jì)算油橄欖葉中橄欖苦苷的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.4.1的方法，得到的橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 橄欖苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，橄欖苦苷在0.0125～0.4 mg/mL內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，以橄欖苦苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到回歸方程為y=746 900 22x+157 53，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 9。

2.2 樣品的測定

2.2.1 油橄欖葉提取液的定性分析

將1.2.3制備的油橄欖葉提取液進(jìn)樣，再用1.2.2制備的40%的橄欖苦苷溶液進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量都為60 μL，分別記錄其保留時(shí)間。從圖2可知油橄欖葉提取液中出現(xiàn)了3個(gè)峰，其中被標(biāo)注為1的峰保留時(shí)間為14.389 min，而圖3中40%的橄欖苦苷的保留時(shí)間為14.401 min，通過對比圖2和圖3可知此處該物質(zhì)的出峰的保留時(shí)間很接近，故可判定在此色譜條件下油橄欖葉中含有橄欖苦苷。

圖2 油橄欖葉提取液的HPLC色譜圖

圖3 40%橄欖苦苷的HPLC色譜圖

2.2.2 樣品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.2.4.2方法進(jìn)行樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 樣品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

由表1可知，將同一批次油橄欖葉提取液樣品間隔進(jìn)樣，測得峰面積變化幅度不大，通過線性回歸方程可得油橄欖葉中的橄欖苦苷的平均含量為3.92 mg/g ，RSD為0.75%，表明油橄欖葉提取液的穩(wěn)定性好，用HPLC測定油橄欖葉中橄欖苦苷的含量滿足分析要求。

2.2.3 樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.2.4.3方法進(jìn)行樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表2可知，將同種油橄欖葉提取液樣品進(jìn)行3次平行測定，通過對比峰面積變化幅度不大，計(jì)算RSD為0.5%，表明用HPLC方法測定油橄欖葉中橄欖苦苷的含量滿足分析要求。

2.2.4 樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

按1.2.4.4方法進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由表3可知，樣品的平均回收率為100.8%，RSD為1.35%，滿足分析測定要求。

2.2.5 樣品中橄欖苦苷含量的測定

按1.2.4.5方法得到的橄欖苦苷的峰面積，結(jié)果見表4，得到的橄欖苦苷的線性回歸方程y=746 90 022x+15 753，計(jì)算出油橄欖葉中橄欖苦苷的含量的平均值為3.92 mg/g。

表4 樣品中橄欖苦苷的含量

3 結(jié)論

本方法用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)建立油橄欖葉中橄欖苦苷的分析測定方法，橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品在0.012 5～0.4 mg/mL內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。通過對油橄欖葉進(jìn)行定性分析，可以確定其中含有橄欖苦苷，對建立的HPLC方法進(jìn)行穩(wěn)定性、重現(xiàn)性分析，并對樣品中橄欖苦苷含量進(jìn)行測定，根據(jù)橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出油橄欖葉中橄欖苦苷的含量為3.92 mg/g。此方法對樣品處理簡單、測定速度快、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，可以用于油橄欖葉中橄欖苦苷含量的測定。

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