石榴皮提取物對實驗性糖尿病小鼠肝臟抗氧化防御功能的影響研究

焦士蓉，唐遠謀2，馮 慧，劉 佳，唐鵬程

(1.西華大學生物工程學院， 四川成都 610039 2.成都大學，四川成都 610106)

石榴皮是石榴干燥后的果皮，它性酸、味道發澀，具有止血、澀腸、殺蟲的效用，是臨床常用中藥[1]。經RC-HPLC分析，發現石榴皮中含安石榴苷、鞣花酸等多酚類物質，且含量較高[2]。研究表明石榴皮提取物具有抑制癌細胞增殖、抗突變、抗菌和抗氧化作用[3-5]。

焦士蓉等[6]對石榴皮提取物體外抗氧化作用的研究表明，石榴皮提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基有清除能力，具有抑制小鼠肝、腎、心組織勻漿脂質過氧化能力。焦士蓉等[7]的研究也發現試驗性糖尿病小鼠肝臟存在氧化損傷。近年來抗氧化防御降低在誘發糖尿病并發癥方面日益受到重視，氧化應激帶來的臟器損傷可能是糖尿病多種并發癥發病機制的共同通道[8]。國外的研究[9]發現石榴汁、石榴皮等有清除自由基的作用，而關于石榴皮體內的抗氧化活性研究少有報道。 本研究旨在探討石榴皮提取物對糖尿病小鼠肝臟抗氧化防御功能的影響，為減輕糖尿病并發癥和開發石榴皮資源提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 石榴皮提取物的制備

石榴皮提取物：采用微波輔助提取技術，石榴皮粉碎，80～100目，以水為溶劑，料液比1∶30，溫度75 ℃，提取2次，每次140 s，合并濾液，60 ℃真空濃縮，冷凍干燥，得淺棕色粉末，并進一步采用大孔樹脂進行純化，得到凍干粉末。經測定石榴皮提取物總多酚含量為(0.717±0.006) g/g。經RP-HPLC測定，石榴皮提取物中安石榴甙含量為46.91%、鞣花酸含量為9.44%、綠原酸含量為0.53%、槲皮素含量為0.75%、表兒茶素含量為0.32%。

1.1.2 實驗動物

健康ICR雄性小鼠，體重28～30 g, 購于簡陽達碩動物科技有限公司,具備合格證。

1.1.3 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ, 美國Sigma 公司)，MDA、NO、GSH水平、SOD、GSH-Px、CAT、NOS、GST活性測定、組織蛋白含量的測定試劑盒(南京建成生物研究所)，日本京都血糖儀GT-1640；GlUCOCARDⅡ 系列血糖儀專用試紙；722紫外可見光柵分光光度計、恒溫水浴鍋、低溫低速離心機、Olypus BX60 熒光正置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型小鼠的建立與分組

清潔級ICR健康雄性小鼠，給藥前稱重，禁食12 h(自由飲水)，腹腔注射75 mg/kg體重的1%STZ，1 d 1次，連續2 d。注射后自由進食，5 d后稱重，禁食不禁水5 h，取尾血測空腹血糖濃度，血糖濃度值大于10 mmol/L的小鼠確定為糖尿病小鼠[10]。

根據空腹血糖水平及體重將糖尿病模型小鼠隨機分為4組：模型對照組(DM, 10只)、模型+低劑量組(DM+L, 10只)、模型+中劑量組(DM+M, 10只)、模型+高劑量組(DM+H, 10只)。模型+低、中、高劑量組分別以0.2、0.4、0.8 g/kg.BW的石榴皮提取物灌胃，模型對照組給予蒸餾水(0.2mL/10g),連續給藥28 d后進行空腹血糖濃度的測定。

1.2.2 正常小鼠的分組及給藥

正常小鼠20只按空腹血糖、體重水平隨機分為陰性對照組(NC)和陰性+高劑量組(NC+H)。陰性對照組給予蒸餾水，陰性+高劑量組以0.8 g/kg的石榴皮的提取物灌胃，1 d 1次，連續給藥28 d后測定空腹血糖濃度。

1.2.3 喂養環境

整個實驗過程中均在有IVCS(individual ventilated cage system)的動物房喂養，所有組均自由進食常規飼料和飲水，室溫20～24 ℃，濕度60%～70%，12 h/12 h明暗周期。

1.2.4 觀察指標及測定方法

試驗過程中每周稱體重，血糖水平用葡萄糖試紙檢測。在第6周末，稱重，斷頸處死動物，取肝臟稱重。稱取適量肝組織，加冷生理鹽水，在冰浴條件下，制成10%的組織勻漿，低溫低速離心，取上清液，T- SOD為黃嘌呤氧化酶法、CAT采用紫外分光光度法、GSH-PX和GSH為二硫代二硝基苯甲酸比色法、NO和NOS為硝酸還原酶比色法、GST為1-氯-2，4-二硝基苯比色法、MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)縮合法測定、組織蛋白含量測定為考馬斯亮蘭法。具體測定方法按照試劑盒要求進行。

1.2.5 組織學檢查

留取肝臟標本，甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosinstain,HE)，顯微鏡觀察。

1.3 統計分析

2 實驗結果

2.1 血糖情況、體重影響比較

喂養初期各組小鼠體重無統計學意義(P>0.05)，第4周實驗結束時糖尿病組小鼠體重低于正常對照組,但無統計學差異。試驗末期，糖尿病組小鼠血糖濃度顯著高于正常對照組(P<0.01)，石榴皮各劑量治療組血糖濃度均顯著低于糖尿病組(P<0.05)，提示石榴皮提取物具有降低血糖濃度的作用。正常+高劑量組血糖濃度與正常組血糖濃度無顯著性差異，說明高劑量石榴皮不會影響正常小鼠的血糖濃度。實驗結果見表1。

表1 各組動物一般情況比較

注：(1)P<0.01 compared with NC group ；(2)P<0.05 compeared with DM group。

2.2 石榴皮提取物對糖尿病小鼠肝臟氧化應激狀況

2.2.1 石榴皮提取物對糖尿病小鼠肝臟MDA、CAT、GSH-PX和SOD的影響

從表2看出，與正常對照組比較，正常+高劑量組小鼠肝臟中CAT含量顯著高于正常組(P<0.01)；SOD、MDA、GSH-PX低于正常組，但無顯著性差異。糖尿病組小鼠肝臟組織中MDA、GSH-PX、CAT顯著高于正常組(P<0.01)；SOD顯著低于正常組(P<0.05)。與糖尿病模型組比較，石榴皮低、中、高劑量組小鼠肝臟MDA、GSH-PX含量均顯著低于糖尿病組(P<0.01)，且呈劑量效應關系。高、中、低劑量組SOD含量均高于糖尿病組(P<0.01或P<0.05)。石榴皮中、高劑量組CAT含量低于糖尿病組(P<0.01)。

表2 石榴皮提取物對糖尿病小鼠肝臟MDA、CAT、GSH-PX和SOD的影響

注：(1)P<0.01 ,(2)P<0.05 compared with NC group ；(3)P<0.01, (4)P<0.05 compeared with DM group。

2.2.2 石榴皮提取物對糖尿病鼠肝臟GSH、NOS、NO、GST的影響

從表3可以看出，與正常對照組比較，正常+高劑量組小鼠NOS、GST顯著降低(P<0.01)，GSH含量升高，但無顯著性差異。糖尿病小鼠GSH、NO降低但無顯著性差異，NOS和GST顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與糖尿病模型組比較，石榴皮高劑量組小鼠肝臟GSH 有顯著升高(P<0.01)，低劑量組也有升高，但無顯著性差異。石榴皮低劑量組小鼠肝臟的NOS含量顯著降低(P<0.01)。NO和GST與糖尿病組無顯著性差異。

表3 石榴皮提取物對糖尿病小鼠肝臟GSH、NOS、NO、GST的影響

注：(1)P<0.01， (2)P<0.05 compared with NC group, (3)P<0.01， (4)P<0.05 compeared with DM group。

2.3 肝臟組織學檢查

正常組小鼠肝組織光鏡下顯示，肝小葉結構正常，肝竇規則，肝細胞索排列整齊，肝細胞無糖原積蓄，無空泡變性(見圖1)。糖尿病小鼠肝糖原蓄積，肝血竇變窄，可見嗜堿性小體，說明肝細胞存在損傷(見圖2)。圖3為正常+石榴皮高劑量組，肝組織在光鏡下顯示，肝小葉結構正常，肝竇規則，肝細胞索排列整齊，肝細胞無糖原積蓄，無空泡變性，說明該劑量下的石榴皮對肝臟無損傷作用。圖4、5、6分別為石榴皮低、中、高劑量治療組同糖尿病組比較：低劑量組部分肝細胞水腫，空泡變性，輕度脂肪變性；中劑量組部分肝細胞水腫，空泡變性，較糖尿病模型組有所減輕；高劑量組個別細胞水腫，空泡變性，較糖尿病模型組肝病變明顯減輕。

圖1 正常小鼠肝組織形態 400×

圖3 正常組+石榴皮高劑量組 400×

圖4 石榴皮低劑量治療組 400×

圖5 石榴皮中劑量治療組 400×

圖6 石榴皮高劑量治療組 400×

3 討論

研究表明氧化應激廣泛存在于糖尿病中[11], 隨著持續的高血糖，組織中自由基增加[12]，產生氧反應產物(reactive oxygen species ,ROS)引起組織損傷。這種損傷作用可導致后期的糖尿病并發癥[13]。在糖尿病慢性并發癥中，肝臟為長期高血糖累及的靶器官之一[14]，糖尿病性肝臟損害主要表現為肝內脂肪浸潤致脂肪肝(Fatty liver，FL)、部分可發展為脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化[15]。本試驗測定石榴皮低、中、高劑量組與糖尿病組比較，均可顯著降低血糖。研究發現，正常組飼喂高劑量石榴皮提取物，與正常組體重、血糖比較，無顯著性差異。與正常組比較GSH升高、MDA降低，但無顯著性差異，NOS和GST顯著降低，CAT顯著升高，說明石榴皮提取物無毒性并具提高機體抗氧化酶，降低脂質過氧化的作用。糖尿病小鼠肝組織與正常對照組比較，SOD、NOS和GST顯著降低，MDA、GSH-Px、CAT活性顯著升高，表明糖尿病處于抗氧化防御機能低下狀態。給予石榴皮提取物治療后，與糖尿病模型組對比，MDA、GSH-PX顯著降低，并呈劑量效應關系，CAT活性顯著降低，SOD活性顯著上升，表明石榴皮能提高糖尿病鼠肝臟抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化反應，對糖尿病鼠抗氧化防御功能具有一定的恢復作用。

從肝組織切片光鏡檢查，看出糖尿病小鼠肝組織細胞存在損傷。石榴皮高劑量組具有保護肝細胞免受損傷的作用。同時高劑量石榴皮具有顯著降低血糖的作用，對于其降糖機制有待進行深入研究。

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