響應面分析法優化腸桿菌的發酵條件生產殼聚糖酶

程仕偉1，孫少華1，張 盈1，陶春彥1，朱 琳1，姜國正

(1．魯東大學生命科學學院應用微生物研究所，山東 煙臺 264025；2. 煙臺恒源生物股份有限公司，山東 煙臺 265709)

殼聚糖是由2-氨基-D-葡萄糖和2-乙酰氨基-D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的多糖，與甲殼素、殼寡糖均被稱為甲殼素類物質，被譽為繼糖類、蛋白質、脂肪、維生素等生命元素之外的第6大生命物質[1]。殼聚糖經降解后得到的殼寡糖與殼聚糖相比具有良好的水溶性，易被機體吸收，且具有許多獨特的生理活性[2]，其商業產品涉及功能性食品、藥品、環保、化工等多個領域[3-5]。殼寡糖的制備可采用化學法和酶降解法，通過化學方法降解殼聚糖制備殼寡糖的方法具有污染環境、產物不均一等缺點[6]。與常用的化學降解法相比，酶降解法生產殼寡糖的反應條件溫和且易控制，產品得率高、功能性強，不會造成環境污染，是殼寡糖制備的主要方法[7-8]。

殼聚糖酶(Chitosanase, EC 3.2.1.132)是一類可專一性催化殼聚糖的β-1,4-糖苷鍵斷裂，制備低分子量殼寡糖的糖苷水解酶[9]，已發現的殼聚糖酶主要屬于糖基水解酶家族8、46 75、80等，廣泛存在于微生物中，在植物組織中也有分布[10]。殼聚糖酶根據其作用位點不同，可分為3類：1)水解 GlcN-GlcN 鍵及 GlcNAc-G1cN 鍵；2)只能水解 G1cN-GlcN 鍵；3)既可水解G1cN-GlcN 鍵又可水解 G1cN-GlcNAc 鍵。所有殼聚糖酶有一個共同催化性質就是要求糖苷鍵的一側至少有1個G1cN 殘基，而不能催化 GlcNAc-G1cNAc鍵的斷裂[2, 11]。不同生物來源殼聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成產物殼寡糖聚合度存在差異[12]。選育產殼聚糖酶的微生物菌株, 并優化酶產量對合成不同聚合度產品具有積極意義。本文對研究室選育的產殼聚糖酶腸桿菌進行培養條件優化，旨在為殼聚糖酶的發酵生產提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產殼聚糖酶的腸桿菌(Enterobactersp.)YT21，為本研究室從新鮮蝦皮組織中分離鑒定并保存。3, 5-二硝基水楊酸購自BBI公司，85%脫乙酰度的殼聚糖購自濟南海得貝生物工程有限公司，其余試劑均為分析純或生物純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器；SW-CJ-1B超凈工作臺，蘇州安泰；H1850R離心機，湖南湘儀實驗室儀器；HZQ-Q全溫搖床，哈爾濱東聯；SPX-250BS生化培養箱，上海新苗。

1.3 菌種活化

培養基(g/L)：葡萄糖 5，酵母粉 3，蛋白胨 10，MgSO4.7H2O 2，pH 7.0。121 ℃滅菌15 min，將斜面保藏菌種挑一環轉接50 mL滅菌培養基，在30 ℃和200 r/min下培養24 h后轉接發酵培養基。

1.4 培養條件優化

采用優化后的培養基進行發酵生產殼聚糖酶，培養基組分(g/L)：葡萄糖 12、 酵母粉 8、 KCl 4、粉末殼聚糖 0.5、 NH4Cl 8、 MgSO4·7H2O 4、 MnSO44、 NaCl 2、粉末殼聚糖 0.5、pH 7.0。在不同溫度、pH和接種量條件下進行發酵培養條件優化，培養36 h后測定殼聚糖酶活力。

1.5 響應面分析優化

根據單因素優化的結果，利用Design-Expert軟件分別對培養溫度、pH和接種量這3個因素進行Box-Benhnken試驗設計。設計17個試驗組，其中中心點試驗5次用于估計試驗誤差，其余組為析因組。以殼聚糖酶活性為響應值，確定最佳發酵工藝條件。

1.6 殼聚糖酶活性測定

發酵液經5 000 r/min離心10 min，取適當稀釋度的上清液1 mL，加入1 mL的1% (m/V) 底物水浴(40 ℃)保溫20 min，加DNS試劑3 mL，沸水浴5 min，定容至25 mL后取4 mL反應樣液在5000 r/min下離心10 min。取離心后上清液以對照組作為空白在520 nm處測定OD值，根據DNS標準曲線，計算其酶活力?？瞻讓φ战M：相同稀釋度的發酵上清液1 mL，沸水浴5 min滅活，再加入相同體積的殼聚糖溶液和DNS，處理方法同樣品組。以單位體積(mL)單位時間(min)水解產生的氨基葡萄糖的μmol數為酶活力的定義單位[13]。

2 結果與分析

2.1 培養溫度對菌株產酶的影響

采用優化培養基，產殼聚糖酶的腸桿菌在pH 7.0、4% (V/V)接種量和200 r/min條件下，考察培養溫度對菌株產酶的影響，發酵36 h后測定酶活力，結果見圖1。由圖1可以看出，菌株在28～35 ℃的溫度區間均有較好的產殼聚糖酶能力，最佳培養溫度為32 ℃，產酶量為7.32 U/mL。當溫度低于28 ℃時，菌體生長緩慢導致殼聚糖酶的產量低。相反的，當溫度高于35 ℃時，菌體生長過快而導致酶產量較低。

圖1 溫度對菌株產酶的影響

2.2 培養pH對菌株產酶的影響

在4% (V/V)接種量、32℃和200 r/min條件下，研究pH對腸桿菌YT21產殼聚糖酶的影響，發酵36 h后測定酶活力，結果見圖2。由圖2可以看出，菌株對pH的適應性較強，在pH 5.5～7.5區間均有較好的殼聚糖酶生產能力，其中在pH 6.0時獲得最大產酶量，活性值為8.22 U/mL。當培養基pH低于5.5或高于7.5時均不利于殼聚糖酶的分泌表達。

圖2 pH對菌株產酶的影響

2.3 接種量對菌株產酶的影響

在pH 6.0、32 ℃和200 r/min條件下，研究接種量對腸桿菌YT21產殼聚糖酶的影響，發酵36 h后測定酶活力。由圖3可以看出，菌株在6%～12% (V/V)的接種量時獲得較大的酶活性，其中8% (V/V)接種量時獲得最大殼聚糖酶活性，為10.73 U/mL。當接種量低于6%時，由于接種量不足導致發酵時間延長從而殼聚糖酶活力低。由圖3還可看出，當接種量高于8%時，發酵測定的酶活力變化不大，顯示最佳接種量為8%。

圖3 接種量對菌株產酶的影響

2.4 響應面分析優化

根據優化的結果，對培養溫度、pH和接種量進行Box-Benhnken試驗設計[14]，因素水平編碼見表1。將培養溫度(A)、pH(B)和接種量(C)3個因素作為自變量，以殼聚糖酶活性(Y)作為響應值，設計17個響應面分析實驗，其中5個為中心試驗，響應面實驗結果與設計如表2所示。

表2 發酵條件優化的響應面設計與結果

采用DesignExpert軟件對所得數據進行回歸分析，結果見表3。培養溫度(A)、pH(B)和接種量(C)的二次多項回歸方程為：殼聚糖酶活性(U/mL) =11.69 + 0.05A+ 1.30B- 1.24C-0.18AB+ 0.62AC+ 0.02BC-2.07A2+0.42B2-1.71C2，其中一次項B、C極顯著(P< 0.01)，二次項A2、C2極顯著(P< 0.01)(表3)。

表3 響應面試驗回歸模型方差分析

注：差異顯著(P< 0.05)；差異極顯著(P< 0.01)。

根據表3可以得出，回歸模型的F=7.58，其P=0.007，表明該模型極為顯著，決定系數R2=0.907 0，表明回歸模型與實際情況擬合性良好，可以用于發酵條件優化。失擬項P=0.1189>0.05，即模型失擬不顯著，說明該方程可以很好地描述各發酵條件和殼聚糖酶活性的關系。各項P值小于0.05時，說明其對模型作用顯著，由P值大小可知，在所選各因素水平范圍內，對發酵生產殼聚糖酶的影響大小分別為培養pH>接種量>培養溫度。信噪比>4是可取的，本模型中為9.655，模擬效果較好。

圖4 培養溫度和pH交互作用對殼聚糖酶活性影響的響應曲面圖

在回歸模型方差分析結果的基礎上，根據得到的回歸二次方程，利用軟件做培養溫度、pH和接種量對殼聚糖酶活性產生影響的響應面圖(分別見圖4、圖5和圖6)，以分析2個因素的交互作用對殼聚糖酶活性的影響。根據所建立的數學模型進行參數最優化分析，得到最優發酵條件為培養溫度31.74 ℃、pH 6.5和接種量為7.26% (V/V)，模型模擬的理論殼聚糖酶最高活性值為13.65 U/mL。

圖5 培養溫度和接種量交互作用對殼聚糖酶活性影響的響應曲面圖

圖6 培養pH和接種量交互作用對纖維素酶活性影響的響應曲面圖

2.5 回歸模型驗證與發酵培養曲線

為檢驗方法的可靠性，采用得到的最優發酵培養條件進行腸桿菌發酵生產殼聚糖酶實驗，其培養曲線見圖7。

圖7 菌株發酵生產殼聚糖酶的培養曲線

發酵36 h后實際得到的殼聚糖酶活性值為13.59 U/mL，實際值與預測值之間的誤差約為0.43%。因此采用響應面優化腸桿菌YT21發酵生產殼聚糖酶條件可靠，具有實用價值。由圖7可看出，殼聚糖酶產量與菌體量呈現不完全對應關系，最大生物量出現在發酵30 h，隨后經短暫靜止期后進入衰退期。腸桿菌YT21發酵生產殼聚糖酶屬于部分生長耦聯型(延續合成型)， 即酶的合成隨著細胞生長量的增加而增加， 在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續合成較長時間，在發酵48 h時獲得最大殼聚糖酶活性，為17.82 U/mL。綜上可判定，該酶為誘導酶，一般不受分解代謝物阻遏和產物阻遏，所對應的mRNA相對穩定，屬于理想的產酶類型，具有深入研究的潛力。

3 結論

首先對腸桿菌YT21發酵生產殼聚糖酶的培養溫度、pH和接種量進行優化，確立中心位點后進行響應面設計分析，優化后發酵培養條件為溫度31.74℃、pH6.5和7.26%(V/V)接種量，培養48h獲得的最大殼聚糖酶活性為17.82U/mL，殼聚糖酶的生產方式為延續合成型，具有深入優化并規模生產的潛力，相關酶學特性與深入優化研究正在進行。

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