響應面分析法優化潲水油中膽固醇的提取條件

(西華大學生物工程學院，四川 成都 610039)

當今世界餐廚廢棄油脂的年產量為15億t，而中國的產量已達到每年450萬t[1]。中國目前有不少不法商販對餐廚廢棄油脂進行二次加工，煉制成潲水油銷售給一些餐飲企業。當前許多經過精煉的潲水油的各項常規指標甚至能夠完全達到國家標準的要求，因此區別合格食用植物油與潲水油關鍵就是篩選、建立有明顯差異的特異性指標[2]。餐廚廢棄油脂中一般混有動物油脂，動物油脂含有膽固醇，而植物油一般不含或含有極少的膽固醇[3]。由于膽固醇的極性很低，在潲水油煉制的過程中很難將其除去。張蕊等[4]和陳初良等[5]通過對膽固醇含量的測定來判別食用油中是否摻入有動物油脂作了研究。陳紅等[6]選擇膽固醇作為潲水油檢測的特異性指標，希望能給食用植物油的安全監管以及完善食用油國家安全標準提供參考。

食用油經過皂化以后，膽固醇和甾醇作為不皂化物[7-8]可被提取出來，因此影響潲水油中膽固醇提取量的主要因素為皂化條件以及提取試劑的選擇。響應面分析法的原理就是用一個多元二次回歸方程擬合多因子試驗中多個因子與試驗結果之間的關系，估計回歸方程的系數，通過對方程求極值的方法達到參數優化的目的[9]。該方法廣泛應用于生產實驗的優化控制中[10-11]。本實驗通過單因素實驗以及響應面分析法對影響膽固醇提取的因子水平及其交互作用進行優化與評價，以期最大限度地將膽固醇提取出來，并利用高效液相色譜法，將提取后的樣品通過色譜柱，在設定的色譜條件下，將膽固醇和植物甾醇分離[12-13]，并定量的分析樣品中膽固醇的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

潲水油由成都市質量監督局提供；玉米一級油、菜籽一級油、花生一級油均購于超市；乙醇、KOH、NaCl、石油醚、乙醚、正己烷、三氯甲烷均為分析純；膽固醇標準品(98%)購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀，日本島津；電子天平，上海精科天平有限公司；漩渦混合器，北京金紫光科技發展有限公司；TTL-DC型氮吹儀，北京同泰聯科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高效液相色譜條件[14]

分析柱：C18反相色譜柱；柱溫：38 ℃；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；測定波長：205 nm；進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 膽固醇標準品的色譜圖

1.3.2 膽固醇標準曲線的繪制

稱取膽固醇標準品50 mg(精確到0.1 mg)，用無水乙醇溶解定容至50 mL，溶液每毫升相當于1 mg膽固醇，放置4 ℃密封可貯藏半年。分別吸取標準貯備液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、3.0 mL用無水乙醇定容至10 mL，配制成標準工作液。在上述色譜條件下測定標準工作液的響應值(峰面積)，以膽固醇質量濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到的線性回歸方程為y=29335970.65x-20817.22，R2=0.999 8，膽固醇質量濃度在0.01～0.3 mg/mL范圍內具有良好的線性關系，最低檢出限為0.709 7 μg/mL。

1.3.3 樣品的測定

稱取200 mg的潲水油油樣置于試管中，加入KOH-乙醇溶液后置于水浴鍋中進行緩慢皂化。待皂化完成后取出冷卻，加入提取劑以及少量NaCl(50 g/L)溶液，在漩渦混合器上充分混合3 min，待靜止分層后把提取液轉移到另一只試管中，重復萃取2次，合并3次提取液并用氮吹儀吹干，而后加入1 mL乙醇復溶，再用0.2 nm的濾膜過濾后置于進樣瓶中進樣測定。

1.3.4 單因素實驗

在其他條件都相同的情況下，分別考察不同的萃取劑、皂化溫度、皂化時間以及KOH-乙醇溶液的濃度對潲水油中膽固醇測定結果的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

根據前期單因素試驗結果，選用正己烷為萃取劑，設定皂化溫度、皂化時間、KOH-乙醇濃度這3個因素為自變量，膽固醇的提取量為響應值，進行Box-behnken設計實驗，設計試驗因素水平及編碼值見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平及編碼值

1.3.6 回收率實驗

分別取100、200、300 μL質量濃度為0.1 mg/mL的膽固醇標準液，加入到合并后的萃取液中，在漩渦混合器上混勻以后進行吹干、復溶，然后過濾進樣。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同提取劑的影響

取200 mg的油樣，加入5mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液，在皂化時間60 min和皂化溫度為65 ℃的條件下進行皂化，萃取劑分別選用乙醚、正己烷、三氯甲烷以及石油醚，實驗結果見表2。

表2 不同萃取劑對膽固醇提取的影響

從表2可以看出，4種萃取劑對膽固醇的提取結果影響不大，三氯甲烷和石油醚的提取量稍低，乙醚和正己烷的提取量稍高，但是乙醚的沸點相對較低，且易于與乙醇互溶，故該實驗中的萃取劑選用正己烷。

2.1.2 皂化溫度的影響

取200 mg的油樣，加入5 mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液分別在55、60、65、70、75 ℃下皂化60 min，冷卻后用正己烷對膽固醇進行提取，測定結果見表3。

表3 不同皂化溫度的影響

由表3的實驗結果可以看出，當皂化溫度不超過65 ℃時，膽固醇的提取量隨溫度的升高而升高，高于65 ℃后，趨于穩定。

2.1.3 皂化時間的影響

取200 mg的油樣，加入5 mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液在65 ℃條件下分別皂化20、40、60、80、100、120 min，冷卻后用正己烷對膽固醇進行提取，測定結果見表4。

表4 不同皂化時間的影響

隨著反應時間的增長，樣品的皂化度增大，但是當時間達到60 min后，膽固醇的含量略有降低。這可能是由于皂化時間的增加，皂化液的濃度[15]和黏度增高，導致皂化度的降低，將部分膽固醇重新包含，降低了膽固醇的提取量。

2.1.4 KOH-乙醇溶液濃度的影響

取200 mg的油樣，分別加入5 mL 0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的KOH-乙醇溶液，在皂化時間60 min和皂化溫度為65 ℃的條件下進行皂化，冷卻后用正己烷對膽固醇進行提取，測定結果見表5。

表5 不同的KOH-乙醇濃度的影響

由表5可以看出，膽固醇含量趨勢在KOH-乙醇濃度為0.5～2.5 mol/L之間時成拋物線，在1.0 mol/L時，含量最高。過低或者過高的KOH-乙醇濃度都不利于油脂中膽固醇的游離，這是因為膽固醇是以膽固醇脂的形式存在于油脂中，若要使膽固醇游離出來，需要在醇堿性及加熱的條件下才可打開脂鍵，因此乙醇量和堿量對打開油脂與膽固醇的脂鍵有直接影響[16]。

2.2 響應面分析及結果

Box-Behnken試驗設計及結果如表6所示。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

利用Design Expert軟件對上述結果進行分析，得出膽固醇含量(Y)對皂化溫度(A)、皂化時間(B)、KOH-乙醇濃度(C)的二次多項回歸方程為:

Y=71.20-0.58A+1.86B-0.19C-0.47A·B+1.87A·C+0.70B·C-3A2-0.83B2-1.63C2

從表7可以看出，實驗所選用模型的P值為0.000 2﹤0.01，這表明模型是顯著的，不同處理之間的差異高度顯著，這說明該實驗方法是可靠的。

表7 回歸模型的方差分析

圖2 皂化時間與皂化溫度對膽固醇提取量影響的等高線和響應曲面

圖2顯示的是當KOH-乙醇濃度水平為0，即1.0 mol/L時，皂化時間和皂化溫度對膽固醇提取量的交互影響效應。由圖2可知，皂化溫度對膽固醇提取量的影響顯著，曲線在圖中表現較陡；而皂化時間對膽固醇提取量的影響不顯著，曲線較為平滑。當皂化溫度升高和皂化時間增長時，膽固醇的提取量逐漸增大，但是當達到一定程度時，膽固醇的提取量又開始逐漸減小。這說明皂化溫度過高和皂化時間過長或者皂化溫度過低和皂化時間過短都會影響膽固醇的提取量。皂化溫度與KOH-乙醇濃度對膽固醇提取量影響的等高線和響應曲面如圖3所示。

圖3 皂化溫度與KOH-乙醇濃度對膽固醇提取量影響的等高線和響應曲面

圖3顯示的是當皂化時間水平為0，即60 min時，皂化溫度與KOH-乙醇濃度對膽固醇含量的交互影響效應。由圖3可以看出，KOH-乙醇濃度對膽固醇含量的影響較為顯著，表現為較陡的曲線，膽固醇的提取量隨KOH-乙醇濃度的增加而增加，但達到某一特定值時，反而開始下降；而皂化溫度對膽固醇提取量的影響也較為顯著。這說明過高或過低的皂化溫度以及KOH-乙醇濃度都會影響膽固醇的提取。皂化時間與KOH-濃度對膽固醇提取量影響的等高線和響應曲面如圖4所示。

圖4 皂化時間與KOH-濃度對膽固醇提取量影響的等高線和響應曲面

圖4顯示的是在皂化溫度水平為0，即65 ℃時，皂化時間和KOH-乙醇濃度對膽固醇提取量的交互影響效應。由圖可知，在一定的皂化溫度條件下，KOH-乙醇濃度的增大和皂化時間的增長有助于膽固醇的提取，但是當2個因素增加到一定程度時，膽固醇的提取量又隨之減小。說明KOH-乙醇濃度過高和皂化時間過長或者KOH-乙醇濃度過低和皂化時間過短都會影響膽固醇的提取。

2.3 驗證試驗

應用實驗設計軟件Design-Expert，采用響應曲面設計中的Box-Behnken設計，對皂化溫度、皂化時間以及KOH-乙醇濃度這3個因素的相互作用進行探討，確定其最佳條件為：皂化溫度66.99 ℃、皂化時間59.18 min、KOH-乙醇濃度為0.89 mol/L。結合實驗的可操作性，選取皂化溫度67 ℃、皂化時間59 min、KOH-乙醇濃度0.9 mol/L進行驗證實驗，測得樣品中膽固醇含量為21.139 5 mg/100g。

2.4 不同油樣及回收率實驗結果

用上述的最佳實驗條件對不同類別的油樣進行測定，得到的實驗結果見表8，回收率實驗見表9。

表8 不同油樣的膽固醇含量

表9 回收率實驗結果 mg/100 g

由實驗結果可知，市面上銷售的合格食用植物油中不含膽固醇，但是潲水油、火鍋油以及煎炸老油中卻有不同含量的膽固醇。回收率實驗結果為88.57%～102.51%，平均回收率為96.03%。

3 結論

通過單因素實驗以及Box—Behnken響應面法實驗，確定了潲水油中膽固醇提取的最佳條件分析為：萃取劑為正己烷、皂化溫度67 ℃、皂化時間59 min、KOH-乙醇濃度0.9 mol/L，在該條件下測得的潲水油樣品中的膽固醇含量為21.1395 mg/100g，較優化前有很大提高。此外對其他不同的油脂中膽固醇的含量進行的測定以及回收率實驗，說明該方法準確可靠。

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