肝硬化大鼠中縫背核5-HT能神經元的表達

朱建忠，劉 冀，王國明，王 娟，隋月林，石葛明(.滄州醫學高等專科學校解剖學和組織胚胎學教研室，河北 滄州 06000；.河北醫科大學基礎醫學研究所神經生物學研究室，河北 石家莊 05007)

·論著·

肝硬化大鼠中縫背核5-HT能神經元的表達

朱建忠1，劉 冀1，王國明1，王 娟1，隋月林1，石葛明2
(1.滄州醫學高等專科學校解剖學和組織胚胎學教研室，河北 滄州 061000；2.河北醫科大學基礎醫學研究所神經生物學研究室，河北 石家莊 050017)

目的觀察肝硬化大鼠中縫背核五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神經元以及雙標神經元的表達變化。方法健康雄性Wistar大鼠20只,分為模型組和對照組各10只，模型組大鼠經皮下注射CCl4結合飲用酒精14周，對照組皮下注射等劑量的生理鹽水。應用5-HT免疫組織化學及5-HT復合NADPH-d免疫組織化學染色雙標方法，觀察中縫背核5-HT能神經元以及雙標神經元的表達變化。結果與對照組相比，模型組大鼠中縫背核5-HT能神經元的數量未見明顯變化，直徑明顯變小，模型組免疫反應陽性強度明顯較對照組增強，神經元的光密度(0.54±0.04)vs(0.48±0.04)(P<0.01)；雙標神經元未見明顯變化。結論肝硬化影響了大鼠中縫背核5-HT能神經元。

肝硬化；大鼠；中縫背核；5-HT；神經元

五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是中樞神經系統一種重要的神經遞質[1-2]，在神經系統分布廣泛，參與調節機體的心理、情緒及行為等多種生理過程[3]。肝硬化晚期常因中樞神經系統(centralnervoussystem，CNS)的功能調節紊亂，引起肝性腦病的發生。研究[4-5]發現，肝硬化患者血液循環中5-HT明顯增多，推測5-HT參與了肝性腦病的發生。也有研究[6]證實，大鼠中縫背核內有許多5-HT能神經元含有還原型輔酶Ⅱ(nicotinamideadenosinedenucleotidehydro-phosphoricacid,NADPH-d)活性。因此，本實驗應用免疫組織化學以及免疫組織化學復合NADPH-d染色雙標的方法，對肝硬化大鼠中縫背核5-HT能神經元及雙標神經元的表達變化進行了研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組:選用健康成年雄性Wistar大鼠20只，均購自河北省實驗動物中心[清潔級，許可證號SCXK(冀)2008-1-003]，體質量150～200g，隨機分成2組，即模型組和對照組，每組各10只。

1.2 肝硬化模型的制備：模型組給予60%CCl4溶液皮下注射，結合5%乙醇自來水溶液飲用；首次注射每只大鼠0.5mL/100g，以后每只0.3mL/100g，每周注射2次，共14周。對照組每周背部皮下注射等劑量的生理鹽水，自來水飲用。

1.3 標本制備：所有大鼠經10%水合氯醛(600mg/kg)腹腔注射麻醉后，經左心室灌注固定，取腦后固定4h(4℃)。然后浸泡于30%蔗糖液(用0.1mol,pH7.4PBS溶解配制)中至組織塊沉底，將所需部位行冠狀位冰凍連續切片，片厚40μm，隔4張取1張，間斷集片于0.1mol，pH7.4PBS中。

1.4 染色

1.4.1 5-HT免疫組織化學染色：正常血清室溫孵育切片30min、1∶8 000兔抗鼠5-HT抗體4℃孵育48h、1∶500生物素化羊抗兔IgG室溫孵育4h、1∶500辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素室溫孵育1h、DAB顯色5min；常規梯度脫水、透明、封片。陰性對照實驗以PBS替代一抗。

1.4.2 5-HT免疫組織化學復合NADPH-d染色：將經5-HT免疫組織化學染色的切片，在0.1molPBS緩沖液漂洗2次后，浸入孵育液(孵育液組成，0.3%Tritonx-100,1g/LNADPH-Ⅱ,0.5g/LNBT)置于37℃ 60～90min，緩沖液終止反應，裱片制片。

1.5 數據采集：在每只動物的中縫背核處選取5張切片。應用IPP6.0圖像分析系統，分析對照組和模型組大鼠的5-HT免疫反應陽性神經元的神經元數目及細胞平均直徑和平均光密度值。應用奧林巴斯顯微鏡，于40倍物鏡下計數1cm2范圍的中縫背核背側部(dorsalraphenucleus-dorsalpart,DRD)和腹側部(dorsalraphenucleus-ventralpart,DRV)5-HT免疫組織化學復合NADPH-d染色的雙標神經元數目；其中，DRD選取1個視野，DRV選取3個視野。

2 結 果

2.1 5-HT免疫組織化學染色結果：對照組大鼠腦內5-HT能神經元主要集中于中腦下丘階段，在低倍鏡下觀察，可見位于中腦水管腹側與兩側內側縱束之間的多細胞聚集區；位于中腦水管腹側的中縫背核5-HT能神經元整體形態呈噴泉樣(圖1A)；與對照組大鼠相比，模型組大鼠中縫背核5-HT能神經元在分布上未見顯著區別，但免疫反應強度明顯高于對照組大鼠(圖1B)。與對照組相比，模型組5-HT能神經元的數量差異無統計學意義(P>0.05)，但直徑明顯減小(P<0.01)，免疫反應強度明顯增強(P<0.01)。見表1。

2.2 5-HT免疫組織化學復合NADPH-d染色結果：在中腦中縫背核5-HT免疫組織化學復合NADPH-d染色的切片，雙標神經元主要集中在DRD和DRV(圖1C,D)。這2個中縫背核亞核團中的5-HT能神經元中，僅有部分5-HT能免疫反應陽性神經元為NOS陽性。與對照組相比，模型組DRD以及DRV，雙標神經元平均數量所占5-HT能神經元比值差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

GroupsQuantityAveragediameter(μm)OpticaldensityControl104．04±25．9910．47±0．620．48±0．04Model101．46±24．18 9．76±0．440．54±0．04t0．2302．9533．354P>0．05<0．01<0．01

GroupsDRDDRVControl8．00±5．2032．33±16．01Model8．75±2．0625．75±9．54t0．4241．116P>0．05>0．05

DRD:dorsal raphe nucleus,dorsal part;DRV:dorsal raphe nucleus,ventral part

3 討 論

5-HT能神經元主要分布于腦干中縫核群[7]。中縫背核是中樞神經系統中富含5-HT能神經元的一個重要核團，只有少量5-HT能神經元分布在中縫核以外的區域如腳間核、藍斑等腦區。本研究結果顯示，肝硬化大鼠中縫背核5-HT能神經元，除了數量變化不明顯外，直徑以及免疫反應強度均出現了明顯的變化。提示肝硬化導致了中縫背核5-HT能神經元的改變，可能參與了肝性腦病的發生。中縫背核5-HT能神經元接受大腦其他部位的纖維投射[5]，并發出纖維投射到腦的其他部位[8-9]。因此，推測肝硬化除影響5-HT能神經元以外，同時還可能累及途經中縫背核的上行和下行的其他神經纖維和(或)某些其他核團及其釋放的遞質，提示中縫背核5-HT在肝硬化導致肝性腦病的過程中，似乎不是作為一個獨立的遞質體系在起作用，而可能是與其他神經遞質共同發揮作用。

研究[6]發現，在大鼠的中縫核內有許多5-HT能神經元含有NADPH-d活性。因此，本研究利用免疫組織化學復合NADPH-d雙標方法，結果發現肝硬化大鼠中縫背核雙標神經元平均數量所占5-HT能神經元比值，與對照組比較差異無統計學意義。關于中縫背核內雙標神經元的纖維投射及其生理功能尚不清楚。研究[10]發現，一氧化氮與5-HT之間在某些功能上存在聯系。如內皮起源的舒張因子，能抑制大腦大血管對5-HT的收縮反應；硝普鈉作為外源性一氧化氮的供體，能抑制5-HT攝取；另外，苯丙胺類衍生物，能夠選擇性地損毀中縫背核內側和外側5-HT神經元軸突，然而，一氧化氮合酶抑制劑或N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑能防止這種毒性，表明一氧化氮可能參與了這種毒害作用。對于肝性腦病的確切發病機制，有待進一步深入研究。(本文圖見封二)

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(本文編輯：趙麗潔)

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《河北醫科大學學報》編輯部

EXPRESSIONOF5-HTNEURONSINDORSALRAPHEOFCIRRHOSISRATS

ZHUJianzhong1,LIUJi1,WANGGuoming1,WAGNJuan1,SUIYuelin1,SHIGeming2
(1.DepartmentofAnatomy,HistologyandEmbryology,CangzhouHighMedicalTrainingSchool,Cangzhou061000,China;2.DepartmentofNeurobiology,BasicMedicineInstitute,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTostudytheexpressionof5-hydroxytryptamine(5-HT)anddouble-labeledneuronsindorsalrapheofcirrhosisrats.MethodsThehealthymaleWistarratsweredividedintomodelandcontrolgroups(n=10).Within14weeks,modelgroupratsweresubcutaneouslyinjectedbyCCl4plusdrinkingethonal.Controlgrouprats

subcutaneouslyinjectionofsodiumchloride.5-HTimmunohistochemistryand5-HTimmunohistochemistrycombinedwithNADPH-dstainingwereusedtodetecttheexpressionof5-HTanddouble-labeledneuronsindorsalrapheofrats.ResultsTheaveragediameter5-HTneuronsindorsalraphedecreasedsignificantlyinthemodelgroupcomparedwiththatofcontrolgroup.Theopticaldensityvalueof5-HTneuronsindorsalraphedincreasedsinificantlyinthemodeofgroup(0.54±0.04)comparedwiththatofcontrolgroup(0.48±0.04)(P<0.01).Thequantityof5-HTneuronsandthedouble-labeledneuronsindorsalraphehasdnosignificantdifferencebetweentwogroups.ConclusionCirrhosisinfluenced5-HTneuronsindorsalrapheofrats.

cirrhosis;rat;dorsalraphenucleus;5-HT;neuron

2013-12-30；

2014-03-29

朱建忠(1978-)，男，河北唐海人，滄州醫學高等專科學校講師，醫學碩士，從事人體解剖學教學及科學研究。

R322．81

A

1007-3205(2014)06-0625-03

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.003