siRNA干擾Caco-2細胞鞘磷脂合酶2（SMS2）基因對藥物轉運體的影響

靳桂英 楊 青

（復旦大學生命科學學院生物化學系 上海 200433）

siRNA干擾Caco-2細胞鞘磷脂合酶2（SMS2）基因對藥物轉運體的影響

靳桂英 楊 青△

（復旦大學生命科學學院生物化學系 上海 200433）

目的研究鞘磷脂合酶2（sphingomyelin synthase 2，SMS2）缺損對人結腸癌細胞（colon cancer cell，Caco-2）中藥物轉運體P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）的表達與功能的影響。方法SMS2特異性siRNA轉染至Caco-2細胞。采用RT-PCR和real-time PCR檢測SMS2-特異性siRNA的干擾效率；采用Western blot法檢測siRNA轉染后P-gp和MRP2蛋白表達的變化；采用胞內蓄積試驗，通過HPLC檢測P-gp及MRP2專一性底物羅丹明123及普伐他汀的蓄積含量，分析下調SMS2水平對Caco-2細胞中P-gp及MRP2功能的影響。結果應用siRNA下調SMS2水平后，P-gp和MRP2的蛋白質水平均顯著下調；胞內蓄積實驗結果顯示羅丹明123及普伐他汀的蓄積量明顯增加，說明P-gp和MRP2的外排功能減弱。結論SMS2基因表達下調對Caco-2細胞中P-gp和MRP2的表達以及功能均有顯著影響。

siRNA干擾；鞘磷脂合酶2（SMS2）；P-糖蛋白（P-gp）；多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（81373396），the Research Fund for the Doctoral Program of High Education of China（20130071110037）and the Key Research Project of biological medicine of Shanghai Committee of Science and Technology（12431900204）.

藥物轉運體（drug transporter）是細胞膜上介導藥物跨膜轉運的特殊轉運蛋白。在藥物的吸收、分布和排泄過程中起著重要的作用，其表達異常增高是造成多藥耐藥現象的重要原因之一［1］，嚴重影響藥物的治療及腫瘤的化療效果。

人類基因組織術語委員會（human gene nomenclature committee，HGNC）根據藥物轉運體序列的相似性，將其主要分為兩大類：溶質轉運蛋白（solute carriers，SLC）家族和ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運體家族。SLC家族由43個亞家族組成，共有298個成員，ABC轉運體家族由7個亞家族組成，共有49個成員［2］。多藥耐藥蛋白和多藥耐藥相關蛋白是ABC轉運體兩種主要的亞家族，其中多藥耐藥蛋白中的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2）負責多種藥物的外排，在腫瘤治療的多藥耐藥中扮演重要角色［3-4］。因此，研究影響P-gp和MRP2表達和功能的因素對于藥物的吸收和分布具有重要影響。

影響藥物轉運蛋白表達的因素有很多，如細胞因子、細胞應激以及轉錄因子等。Blokzijl等［5］發現炎癥細胞因子TNF-α、IFN-γ89和IL-1β共同孵育人腸黏膜活體組織會導致MDR1的mRNA表達下降；由各種化學物質和生理病理條件引起的細胞應激影響藥物轉運體的表達［6-8］；在BSEP/Bsep啟動子區域存在IR-1反應元件，是核轉錄因子FXR/RXR異源二聚體的結合位點，結合后可激活BSEP/Bsep的轉錄［9］。除此以外，藥物轉運體作為一種重要的膜蛋白，其表達和功能也受到膜脂的調控。藥物轉運體所處的脂環境可能影響藥物轉運體的催化活性，并能為其提供裝載底物的平臺［10］；有研究表明，鞘磷脂（sphingomyelin，SM）和膽固醇影響ABC轉運體的定位和功能［11］；另外，膽固醇的消耗可降低P-gp的功能［12-14］；但是SM對P-gp和MRP2的影響的研究尚不多見。

SM是重要的膜組分，占動物細胞膜成分50％以上。由親水頭部（磷酸膽堿）和兩條疏水尾巴（鞘胺醇和脂肪酸鏈）組成。鞘磷脂合酶（sphingomyelin synthase，SMS）是SM合成途徑中的最后一個酶，催化神經酰胺（ceramide，Cer）和卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）生成SM和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）。哺乳動物SMS有兩個亞型，即SMS1和SMS2，SMS1定位于順面高爾基體，而SMS2定位于細胞膜［15-16］。目前對SM和SMS的研究多為SMS異常表達與動脈粥樣硬化發生的關系以及對細胞凋亡的影響。有臨床研究認為，人血漿SM水平是心血管疾病的危險因子［17］；有研究證實SMS1/2 siRNA減少了DAG和SM的水平，從而降低了動脈粥樣硬化的風險［18］。SMS1和SMS2的過表達增加了CHO細胞的SMS活性和細胞膜SM水平，增強了DAG和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活介導的細胞凋亡效能，也增加了TNF-α誘導的CHO細胞凋亡［19］。雖然SM是一種重要的膜組分，但其對藥物轉運體表達影響的研究尚不多見。在巨噬細胞中，SMS2的缺失可以顯著下調ABCA1與ABCG1蛋白的表達［20］；在SMS2敲除的小鼠腦中P-gp蛋白表達量顯著下調［21］。

人結腸癌細胞（colon cancer cell，Caco-2）是研究藥物轉運體的常用模型。實驗證實P-gp和MRP2在該細胞中均有較高表達［22］。目前尚無采用該細胞株研究SM水平與藥物轉運體P-gp和MRP2之間的關系。本文運用RNA干擾技術，研究SMS2缺損對Caco-2細胞中P-gp和MRP2表達與功能的影響，以期為尋找增加口服藥物吸收攝取的潛在靶標提供新的思路，對于逆轉由多藥耐藥引起的腫瘤治療失敗具有重要意義。

材料和方法

藥品和試劑DMEM培養基、非必需氨基酸、青鏈霉素和0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA（美國Gibco公司）；標準蛋白標記［天根生化科技（北京）有限公司］；96孔酶標板（上海精睿生物科技發展有限公司）；RT-PCR Kit、Trizol試劑（北京博大泰克生物基因技術有限公司）；DNA標記（加拿大Fermentas公司）；PCR薄壁管（美國Axygen公司）；GAPDH一抗、BCA蛋白定量試劑盒、基因組DNA小量抽提試劑盒（碧云天生物技術研究所）；P-gp一抗（英國Abcam公司）；MRP2一抗（美國CST公司）；HRP標記二抗（北京鼎國昌盛生物有限責公司）；引物（美國Invitrogen公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；羅丹明123（百靈威生物技術有限公司）；普伐他汀（貝達醫藥開發有限公司）；SYBR Premix EX Tag（日本Takara公司）；ECL顯色液（美國GE Healthcare公司）。

儀器和設備722分光光度計（上海分析儀器總廠）；垂直平板電泳槽（北京百晶生物技術有限公司）；轉膜儀、PCR儀（美國Bio-Rad公司）；高速離心機、Thermo Muliskan MK3酶標儀、超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）；SCS-24恒溫搖床（江蘇太倉實驗設備廠）；凝膠成像系統（上海實驗設備儀器廠）；安捷倫1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Typhoon FLA9000（美國GE Healthcare公司）。

細胞培養和轉染在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養液中，于37℃，5％CO2條件下常規培養Caco-2細胞，隔天換液。選取對數生長期細胞，胰酶消化，細胞計數板計數并調整細胞濃度為5×105/mL，傳代接種至6孔板中，待細胞生長至60％～70％匯合度，更換培養液（不含血清），進行siRNA轉染。實驗分為空白對照組（即未處理細胞組）、陰性對照組和SMS2 siRNA干擾組。轉染操作按照LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）說明書進行，各組siRNA和Opti-MEM充分混合，室溫放置20min。將轉染復合物加入相應孔板中，培養6h，換為含10％FBS的DMEM培養液，轉染48h后收集細胞進行相關實驗。

siRNA制備根據GENE BANK公布的人SMS2（NC-000004.11）全長序列，采用文獻中已經公布的有效siRNA序列［23］，并設計陰性對照，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。序列如下：SMS2 siRNA正義鏈5′-AGAAGTGACGAGGCGAAT-3′，反義鏈5′-GATACAAGTCAATAGTGGGACG-3′；陰性對照正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

RT-PCR檢測轉染（方法如前）的Caco-2細胞（48h后）用Trizol試劑，按說明書提供操作方法抽提總RNA后進行UV分光光度準確定量，以1μg RNA進行逆轉錄，β-actin作為內參，引物序列如表1所示。PCR反應條件為：96℃預變性5min；96℃變性1min，54℃退火1min，72℃延長1min，反應循環25次（β-actin）或35次（SMS2）。采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

表1 RT-PCR檢測的引物序列Tab 1 Primer sequence of RT-PCR

real-time PCR檢測取1μg總RNA進行反轉錄，使用SYBER Green法對目的基因進行相對定量，β-actin作為內參，引物序列如表1所示。PCR反應條件：96℃預變性5min，96℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，反應循環38次。數據分析采用MyIQ軟件。

Western blot檢測轉染的Caco-2細胞（48h后）提取總蛋白，經BCA法測定蛋白濃度。10％聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5％脫脂奶粉封閉1h，一抗為1∶1 000稀釋的P-gp，1∶1 000稀釋的MRP2和GAPDH。經PBS-Tween（0.3％）洗膜后孵育相應二抗并使用ECL PLUS試劑盒顯色，雜交信號由Typhoon FLA9000掃描，條帶密度由Image Quant軟件分析，以GAPDH作為內參，數據處理以目的蛋白/GAPDH的比值確定。

羅丹明123或普伐他汀的Caco-2細胞內蓄積試驗將轉染（方法如前）的Caco-2細胞（48h后）用PBS洗凈，每孔加5μmol/L羅丹明123，或0.5mmol/L普伐他汀。37℃放置1h，迅速吸走藥物溶液，冰冷的PBS清洗3次。制成200μL細胞懸液，細胞破碎儀超聲破碎。3000×g離心15min，取上清，加等體積甲醇，4℃下放置30min去除蛋白后，17 000×g離心60min取上清，用于HPLC定量分析。同時每孔取0.125mL的細胞懸液按照BCA蛋白濃度測定方法進行蛋白定量。將每孔的細胞內的羅丹明123或普伐他汀濃度除以相應的總蛋白含量，用以消除每孔細胞數量帶來的誤差。

HPLC樣品測定用HPLC測定羅丹明123和普伐他汀的含量，色譜條件：采用Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為25℃；流動相為50mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH=3.0）∶乙腈=67∶33；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；羅丹明123的熒光檢測器：激發波長為485nm，發射波長為565nm；普伐他汀的紫外檢測器波長為239nm。

統計學分析統計學分析采用SPSS 11.0統計軟件。從轉染到檢測的整體試驗重復3次以上，所有數據以xˉ±s表示。兩組數據間的差異用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

Caco-2細胞中SMS2、P-gp、MRP2基因的表達水平觀察Caco-2細胞中是否有SMS2、P-gp、MRP2基因的表達，未處理的Caco-2細胞匯合度達90％后提取RNA，RT-PCR結果顯示Caco-2細胞中SMS2、P-gp、MRP2基因均有表達（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測Caco-2細胞中SMS2、P-gp、MRP2基因的表達水平Fig 1 Gene expressions of SMS2，P-gp and MRP2 in Caco-2 cells detected by RT-PCR

SMS2 siRNA下調SMS2 mRNA的表達水平觀察SMS2敲低后Caco-2細胞中SMS2 mRNA水平上表達的變化（圖2）。siRNA轉染后，Caco-2細胞中SMS2敲低組SMS2的表達水平較空白對照組、陰性對照組表達水平下調50％左右，與RT-PCR的結果一致。

SMS2基因敲低后P-gp和MRP2蛋白表達水平顯著下調觀察SMS2敲低后Caco-2細胞中藥物轉運體P-gp、MRP2蛋白水平上表達的變化（圖3）。siRNA轉染后Caco-2細胞中SMS2敲低組P-gp蛋白水平的表達較空白對照組、陰性對照組降低了40％；SMS2敲低組MRP2蛋白水平的表達較空白對照組、陰性對照組降低了45％。

圖2 SMS2基因敲低后SMS2 mRNA水平的變化Fig 2 SMS2 RNA level after SMS2 gene knockdown

圖3 SMS2基因敲低后P-gp和MRP2蛋白的表達變化Fig 3 P-gp and MRP2 protein expressions after SMS2 gene knockdown

SMS2基因敲低后P-gp和MRP2蛋白的功能明顯減弱觀察SMS2敲低后Caco-2細胞中藥物轉運體P-gp和MRP2功能變化（圖4）。Caco-2細胞內P-gp和MRP2的專一性底物蓄積量能反映其外排功能，蓄積量越小，外排功能越強。繪制標準曲線，得到峰面積與底物濃度的關系曲線（圖4A和4B）。siRNA轉染后Caco-2細胞中SMS2敲低組胞內羅丹明123的蓄積較空白對照組、陰性對照組增加了45％，即P-gp外排功能明顯減弱（圖4C）；SMS2敲低組胞內普伐他汀的蓄積較空白對照組、陰性對照組增加了50％左右，即MRP2外排功能明顯減弱（圖4D）。

圖4 SMS2基因敲低后P-gp和MRP2蛋白的功能變化Fig 4 Functions of P-gp and MRP2 after SMS2 gene knockdown

討論

由于Caco-2細胞形態及生化性質與小腸上皮細胞相似，該細胞已廣泛用于藥物分子腸吸收的體外模型研究。實驗證實，在Caco-2細胞中PEPT1、MDR1、MRP2和OATP-B均有較高水平表達［22］。其中P-gp和MRP2負責多種藥物的外排［4］，因此其表達和功能的變化對于藥物的吸收和分布具有重要影響。

藥物轉運體作為一種特殊的膜蛋白家族，其表達受其所屬脂環境的影響［11，24］。SM是動物細胞膜的重要組分，SMS2是SM合成的關鍵酶，其表達異常影響細胞中SM的含量。

本研究用SMS2 siRNA轉染Caco-2細胞，觀察SMS2缺損對Caco-2細胞中藥物轉運體P-gp及MRP2表達與功能的影響。結果顯示，應用SMS2 siRNA干擾Caco-2細胞后，SMS2 m RNA水平表達顯著下降，說明RNA干擾是有效的。SMS2 siRNA干擾Caco-2細胞48h后，P-gp的蛋白表達水平相對于空白對照組、陰性對照組降低了40％；胞內特異性底物蓄積實驗結果顯示P-gp的外排功能減弱，且減弱水平與蛋白表達下調水平程度相當，推測P-gp外排功能的減弱是由其表達水平降低引起的。在前期研究中，我們發現在SMS2基因缺失的小鼠腦中P-gp的表達與功能均有顯著下調［21］，與我們在Caco-2細胞中得到的結果一致，再次驗證了SMS2與P-gp之間的關系。

本實驗首次發現SMS2敲低后MRP2的蛋白水平較空白對照組、陰性對照組降低了45％，且外排功能也相應減弱，說明SMS2與MRP2的表達及功能密切相關。因此，SMS2基因缺損對Caco-2細胞中P-gp和MRP2的表達以及功能均有顯著作用。預示SMS2可能成為增加口服藥物吸收攝取的潛在靶標，為逆轉腫瘤治療中出現的多藥耐藥現象提供了新的思路。

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Effects of sphingomyelin synthase 2（SMS2）interefered by siRNA on drug transporters in Caco-2 cells

JIN Gui-ying，YANG Qing△
（Department of Btochemtstry，School of Ltfe Sctences，Fudan Untverstty，Shanghat200433，Chtna）

ObjectiveTo study the effect of sphingomyelin synthase 2（SMS2）defect on the expression and function of drug transporters P-glycoprotein（P-gp）and multidrug resistance-associated protein 2（MRP2）in human colon cancer（Caco-2）cells.MethodsSMS2-specific siRNA was transfected into Caco-2 cell.RT-PCR and real-time PCR were employed to detect the efficiency of siRNA.Western blot was used to examine the protein expressions of P-gp and MRP2.Intracellular accumulation experiment was carried out to evaluate the effect of SMS2 down-regulation level on the functions of P-gp and MRP2 in Caco-2 cells.HPLC analysis was used to decect the accumulation amounts of parvastain and rhodamine 123，the specific substrates of P-gp and MRP2.ResultsThe expressions of P-gp and MRP2 were down-regulated in SMS2 knockdown cells treated by siRNA.Cellular accumulation experiments revealed that the excretion function of P-gp and MRP2 in SMS2 deficient cells was decreased，as the accumulation of rhodamine 123 and parvastain was increased significantly.ConclusionsThe down-regulation of SMS2 gene on the expression and function of P-gp，MRP2 in Caco-2 cell.

siRNA interference；sphingomyelin synthase 2（SMS2）；P-glycoprotein（P-gp）；multidrug resistance-associated protein 2（MRP2）

△Corresponding author E-mail：yangqing68@fudan.edu.cn

Q 241

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.001

（81373396）；教育部博士點基金（20130071110037）；上海市科委生物醫藥重點課題（12431900204）

2013-12-17；編輯：段佳）