survivin和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤（SNM）中的表達(dá)及其臨床意義

朱文嘉 李詩(shī)敏 王紓宜

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200032）

survivin和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤（SNM）中的表達(dá)及其臨床意義

朱文嘉▲李詩(shī)敏▲王紓宜△

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200032）

目的探討survivin和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤（sinonasal melanoma，SNM）中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法選取2004年3月至2011年8月在本院治療的42例SNM患者的石蠟標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)survivin和PCNA在SNM組織中的表達(dá)情況，分析survivin和PCNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果survivin和PCNA表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位、淋巴轉(zhuǎn)移部位及個(gè)數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）；腫瘤組織中survivin蛋白表達(dá)率為73.8％（31/42），PCNA蛋白表達(dá)率為100％（42/42）；單因素分析結(jié)果顯示，survivin高表達(dá)患者無(wú)瘤生存期（disease free survival，DFS）及總生存期（overall survival，OS）明顯低于survivin低表達(dá)者（P＜0.05）；患者臨床分期及survivin表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多因素分析結(jié)果顯示臨床分期和survivin表達(dá)水平是SNM患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素。PCNA表達(dá)與SNM患者DFS、OS無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論survivin表達(dá)水平與SNM患者預(yù)后相關(guān)，可作為評(píng)估SNM患者預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

黑色素瘤；鼻腔；鼻竇；survivin；增殖細(xì)胞核抗原；預(yù)后

*This work was supported by the Research Project of Shanghai Health Bureau（2009026）and the Research Fund of Eye and ENT Hospital of Fudan University（EENT-2009-14）.

鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤（sinonasal melanoma，SNM）是一種來(lái)源于呼吸道黏膜的樹(shù)突狀黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，可廣泛浸潤(rùn)，并可通過(guò)淋巴結(jié)或血道轉(zhuǎn)移。原發(fā)于鼻腔者僅占全部惡性黑色素瘤的1％。目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療效果也不理想，5年生存率較低。主要與其發(fā)病部位隱蔽、組織構(gòu)成復(fù)雜有關(guān)。早期診斷、及時(shí)徹底切除病灶可以提高治愈率。

細(xì)胞增殖和凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生的兩大因素。關(guān)于survivin和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)在多種腫瘤中均有研究，如鼻咽癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、胃腸道間質(zhì)瘤［1-6］等，但其在SNM中的研究國(guó)內(nèi)外還未有報(bào)道。本課題旨在探討腫瘤細(xì)胞增殖和抑凋亡相關(guān)標(biāo)志物與SNM復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床判斷預(yù)后和選擇治療方案提供理論依據(jù)。

資料和方法

研究對(duì)象選取2004年3月至2011年8月在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉醫(yī)院耳鼻喉科治療的42例SNM患者的石蠟標(biāo)本。收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、淋巴轉(zhuǎn)移部位及個(gè)數(shù)。臨床分期參照國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）在2005年出版的《WHO腫瘤分類(lèi)ˉˉˉ頭頸部腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》所制訂［7］。

病例一般情況男性23例、女性19例；年齡40～86歲，中位年齡為61歲。臨床主要癥狀為鼻阻、鼻出血、涕血等。有2例發(fā)生于雙側(cè)鼻腔，1例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；40例為單側(cè)鼻腔（左側(cè)20例，右側(cè)20例）：局限于鼻腔22例，鼻腔鼻竇受累12例，鼻腔及顱底受累1例，鼻腔及咽口1例，鼻腔及軟腭1例，鼻腔、篩竇及眶底1例，鼻腔及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例。42例病理診斷為惡性黑色素瘤，Ⅰ期39例，Ⅱ期3例。

隨訪情況42例患者中，16例患者行單純手術(shù)治療，3例行單純放療，5例行手術(shù)、放療和化療，13例行手術(shù)和放療，5例行其他治療。隨訪至2013年10月31日，最短隨訪時(shí)間2個(gè)月，最長(zhǎng)65個(gè)月，中位隨訪時(shí)間24個(gè)月。

免疫組化切片常規(guī)脫蠟，以3％過(guò)氧化氫室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS液洗，經(jīng)抗原微波修復(fù)分別以鼠抗人PCNA單克隆抗體（克隆號(hào)PC10，上海基因科技公司，稀釋濃度1∶300）及兔抗人survivin單克隆抗體（克隆號(hào)EP2880Y，上海基因科技公司，稀釋濃度1∶400）4℃過(guò)夜，之后En Vision二抗（丹麥DAKO公司）37℃孵育30min，DAB顯色液，蘇木精復(fù)染、封片。以PBS緩沖液代替一抗，其他步驟不變，結(jié)果作為陰性對(duì)照。

結(jié)果的評(píng)價(jià)所有病理切片由2位不了解患者病情及研究?jī)?nèi)容的病理科醫(yī)師共同判斷。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，PCNA、survivin陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度陰性計(jì)0分，輕度染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，強(qiáng)染色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞范圍：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，1％～25％計(jì)1分，25％～50％計(jì)2分，≥50％計(jì)為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞范圍×染色強(qiáng)度評(píng)分：＜2分計(jì)陰性，≥2分計(jì)為陽(yáng)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用±s表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。單因素分析時(shí)數(shù)值變量用t檢驗(yàn)，分類(lèi)變量用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行Logistic多因素回歸分析。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

SNM組織中survivin、PCNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系對(duì)42例SNM患者的組織標(biāo)本進(jìn)行分析，survivin表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征（年齡、性別、腫瘤分期）無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PCNA染色均為強(qiáng)陽(yáng)性，與患者臨床病理學(xué)特征無(wú)相關(guān)性（表1）。

表1 survivin表達(dá)與SNM患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Associations between survivin expression and clinicopathologic features of SNM patients ［n（％）］

survivin和PCNA染色表達(dá)情況survivin在SNM患者腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為73.8％，主要定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃或棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞彌漫或局灶性分布（圖1A、B）；PCNA在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為100％，主要定位于腫瘤細(xì)胞核，呈棕黃色至深褐色灶性分布（圖1C）。

圖1 survivin和PCNA在SNM組織中的表達(dá)情況（×200）Fig 1 Survivin and PCNA expressions in SNM tumor tissues（×200）

survivin和PCNA表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系對(duì)survivin的表達(dá)情況與患者無(wú)瘤生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系進(jìn)行分析，隨訪至2013年10月31日，42例患者中39例患者首次治療后發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，37例患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡，中位無(wú)瘤生存時(shí)間為6個(gè)月，總中位生存期為24個(gè)月。survivin表達(dá)陽(yáng)性的患者的DFS及OS均低于survivin表達(dá)陰性的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 survivin表達(dá)與SNM患者預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Associations between survivin expressions and SNM patients'prognosis

單因素及多因素分析通過(guò)Kaplan-Meier、Cox回歸及Log-rank檢驗(yàn)可見(jiàn)，survivin是否表達(dá)及臨床分期是SNM患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素，并且survivin表達(dá)水平高的患者的預(yù)后明顯差于survivin表達(dá)水平低的患者（P＜0.05，表2、3，圖3）。

表2 SNM患者預(yù)后的單因素及多因素分析Tab 2 Univariate and multivariate analysis of SNM patients'prognosis

表3 survivin不同表達(dá)水平的比較Tab 3 Analysis of different levels of survivin expression

圖3 survivin不同表達(dá)水平與SNM患者OS的關(guān)系Fig 3 Association of OS of SNM patients with different levels of survivin expression

討論

腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖和（或）凋亡受到抑制是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。survivin蛋白是目前凋亡抑制蛋白（inhibitor of apotosis protein，IAP）家族成員中最強(qiáng)的凋亡抑制因子，它通過(guò)抑制Caspase-3和Caspase-7的活性以及與CDK4、CDK2相互作用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)［8］。survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，survtvtn基因是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的調(diào)亡抑制因子。它在抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞有絲分裂以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的表達(dá)改變等方面發(fā)揮著作用［9］。survivin在惡性腫瘤和正常成人細(xì)胞中的表達(dá)有顯著不同，它在正常成人組織中幾乎檢測(cè)不到，而在實(shí)體腫瘤以及惡性血液疾病中表達(dá)增加［9］。survivin作為生物標(biāo)志物在結(jié)直腸癌、卵巢漿液性腫瘤、膀胱癌、骶骨脊髓瘤等均有表達(dá)［10-13］，不同的研究發(fā)現(xiàn)survivin的高表達(dá)與患者預(yù)后呈現(xiàn)截然相反的結(jié)果。在卵巢漿液性腫瘤、結(jié)直腸癌、急性髓細(xì)胞性白血病、喉癌等［10-11，14-15］研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核中survivin的高表達(dá)提示患者預(yù)后良好；而在乳腺癌、食管鱗狀上皮癌［16-18］的研究中則發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)survivin的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。

本研究發(fā)現(xiàn)survivin在SNM中的特異性表達(dá)，且表達(dá)定位于胞質(zhì)、胞核。與前期survivin在其他腫瘤中的研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，survivin在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移組及無(wú)復(fù)發(fā)、無(wú)轉(zhuǎn)移組之間并無(wú)顯著差異，提示survivin在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移未發(fā)揮重要作用。同時(shí)，survivin表達(dá)陽(yáng)性患者的DFS和OS明顯低于survivin表達(dá)陰性的患者。在分析survivin與患者生存時(shí)間關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，survivin表達(dá)量的高低與患者生存時(shí)間存在相關(guān)性。表達(dá)量較高患者的OS相較于表達(dá)量較低的患者有所縮短。但是，survivin的表達(dá)量在發(fā)生復(fù)發(fā)、無(wú)轉(zhuǎn)移的SNM組織間及未發(fā)生復(fù)發(fā)、無(wú)轉(zhuǎn)移的SNM組織間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與黑色素瘤分化差、腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)有關(guān)。

PCNA蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為36 000的酸性蛋白質(zhì)，僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核內(nèi)，在G0及G1期無(wú)明顯表達(dá)，G1期的晚期開(kāi)始表達(dá)，逐漸增加，到S期達(dá)到最高濃度，在G2期和M期表達(dá)明顯減少［19］。PCNA表達(dá)量的變化與DNA合成一致，可作為細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)［20］。因此，PCNA逐漸用于腫瘤的研究中。一些學(xué)者認(rèn)為PCNA指數(shù)與腫瘤分期、分級(jí)以及生存率存在明顯相關(guān)性［21］，但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PCNA指數(shù)與腫瘤的分期、分級(jí)及生存率無(wú)明顯相關(guān)性［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在SNM組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為100％，與腫瘤的各影響因素均不相關(guān)。推測(cè)可能與PCNA是反映增殖活動(dòng)的重要指標(biāo)有關(guān)。本研究結(jié)果驗(yàn)證了惡性黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，其細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，因此僅根據(jù)PCNA表達(dá)無(wú)法確定不同組別的差異。

綜上所述，本研究認(rèn)為survivin可作為評(píng)估SNM預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)，并能為今后SNM靶向治療提供潛在理論依據(jù)，而鑒于惡性黑色素瘤的高度惡性特性，PCNA不能做為獨(dú)立的研究標(biāo)記。

［1］黃東海，田勇泉，邱元正，等.應(yīng)用PCNA和survivin預(yù)測(cè)鼻咽癌放療敏感性的研究［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，27（5）：39-42.

［2］鄒磊，李道堂，穆殿斌，等.食管鱗狀細(xì)胞癌組織中survivin和Cox-2及PCNA表達(dá)臨床意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14（7）：534-537.

［3］趙瑞寧，陳福寶，師宏斌，等.survivin和PCNA蛋白在膀胱癌中的表達(dá)及意義［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30（2）：108-110.

［4］史惠蓉，陳志敏，梁愛(ài)青.子宮內(nèi)膜癌組織中survivin和PCNA的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，40（3）：408-410.

［5］張艷霞，章培軍，閆燕艷，等.Ki-67、PCNA和survivin在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，51（1）：67-70.

［6］Wang W，Luo H，Wang A.Expression of survivin and correlation with PCNA in osteosarcoma［J］.J Surg Oncol，2006，93（7）：578-584.

［7］Barnes L，Eveson J，Reichart P，et al.World health organization classification of tumours：pathology and genetics of head and neck tumours［M］.France：IARC Press，2005：72-73.

［8］Suzuki A，Hayashida M，Ito T，et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16（INK4a）and Cdk2/cyclin E complex activation［J］.Oncogene，2000，19（29）：3225-3234.

［9］Li F，Ling X.Survivin study：an update of“what is the next wave？”［J］.J Cell Phystol，2006，208（3）：476-486.

［10］Huang YJ，Qi WX，He AN，et al.The prognostic value of survivin expression in patients with colorectal carcinoma：a meta-analysis［J］.Jpn J Cltn Oncol，2013，43（10）：988-995.

［11］Davidson B，Smith Y，Nesland JM，et al.Defining a prognostic marker panel for patients with ovarian serous carcinoma effusion［J］.Hum Pathol，2013，44（11）：2449-2460.

［12］Srivastava AK，Singh PK，Srivastava K，et al.Diagnostic role of survivin in urinary bladder cancer［J］.Astan Pac J Cancer Prev，2013，14（1）：81-85.

［13］Chen C，Yang HL，Chen KW，et al.High expression of survivin in sacral chordoma［J］.Med Oncol，2013，30（2）：529.

［14］Carter BZ，Qiu Y，Huang X，et al.survivin is highly expressed in CD34（+）38（-）leukemic stem/progenitor cells and predicts poor clinical outcomes in AML［J］.Blood，2012，120（1）：173-180.

［15］Marioni G，Agostini M，Bedin C，et al.Survivin and laryngeal carcinoma prognosis：nuclear localization and expression of splice variants［J］.Htstopathology，2012，61（2）：247-256.

［16］Li C，Li Z，Zhu M，et al.Clinicopathological and prognostic significance of survivin over-expression in patients with esophageal squamous cell carcinoma：a meta-analysis［J］.PLoS One，2012，7（9）：e44764.

［17］Kennedy S M，O′Driscoll L，Purcell R，et al.Prognostic importance of survivin in breast cancer［J］.Br J Cancer，2003，88（7）：1077-1083.

［18］Dedic PN，Jakic-Razumovic J，Kulic A，et al.Prognostic value of proliferation markers expression in breast cancer［J］.Med Oncol，2013，30（2）：523.

［19］Wang SC.PCNA：a silent housekeeper or a potential therapeutic target？［J］.Trends Pharmacol Sct，2014，35（4）：178-186.

［20］Bravo R，F(xiàn)rank R，Blundell PA，et al.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta［J］.Nature，1987，326（6112）：515-517.

［21］Delahunt B，Bethwaite PB，Nacey JN，et al.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression as a prognostic indicator for renal cell carcinoma：comparison with tumour grade，mitotic index，and silver-staining nucleolar organizer region numbers［J］.J Pathol，1993，170（4）：471-477.

［22］Dirim A，Haberal AN，Goren MR，et al.VEGF，COX-2，and PCNA expression in renal cell carcinoma subtypes and their prognostic value［J］.Int Urol Nephrol，2008，40（4）：861-868.

Expressions and significances of survivin and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in sinonasal melanoma（SNM）

ZHU Wen-jia▲，LI Shi-min▲，WANG Shu-yi△
（Department of Pathology，Eye，Ear，Nose and Throat Hospttal，F(xiàn)udan Untverstty，Shanghat200032，Chtna）

ObjectiveTo explore the expressions of survivin and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in sinonasal melanoma（SNM）and their predictive values for recurrence and metastasis.MethodsWe collected 42 paraffin-embedded samples of SNM treated in our hospital from Mar.，2004 to Aug.，2011.Survivin and PCNA were detected in the tissues of SNM by immunohistochemistry.The differences of survivin and PCNA expressions in the tissues were evaluated and matched with clinicopathological parameters and survival，respectively.ResultsBoth survivin and PCNA expressions were not significantly associated with patients′clinicopathological features（P＞0.05）.Expression of survivin was detected in 31 patients（73.8％）.Expression of PCNA was detected in 42 patients（100％）.Univariate analysis indicated that disease free survival（DFS）and overall survival（OS）of patients with survivin high expression were lower than those with survivin low expression（P＜0.05）.Positive expression of survivin and clinical stage were the prognosis factors for patients with sinonasal melanoma（P＜0.05）.Multivariate analysis indicated that clinical stage and expression of survivin were independent prognosis factors.Expression of PCNA was not significantly associated with DFS and OS of patients.ConclusionsThere was correlation between the expression of survivin and prognostic impact in patients with SNM.It might be an important factor in valuing the prognosis of patients with SNM.

melanoma；nasal cavity；paranasal sinuses；survivin；proliferating cell nuclear antigen（PCNA）；prognosis

R 730.23

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.005

上海市衛(wèi)生局科研課題（2009026）；復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院院級(jí)基金（EENT-2009-14）

▲Co-first authors

△Corresponding author E-mail：sywangsh@hotmail.com

2014-01-20；編輯：張秀峰）