末端結合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達及其對自噬標志蛋白表達的影響

朱興春 劉青松 楊慧敏 方定志

（1四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物化學與分子生物學教研室 成都 610041；2川北醫學院附屬醫院檢驗科 南充 637000；3川北醫學院病理教研室 南充 637007）

末端結合蛋白1（EB1）在宮頸組織中的表達及其對自噬標志蛋白表達的影響

朱興春1，2劉青松2楊慧敏3方定志1△

（1四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物化學與分子生物學教研室 成都 610041；2川北醫學院附屬醫院檢驗科 南充 637000；3川北醫學院病理教研室 南充 637007）

目的探討末端結合蛋白1（end-binding protein 1，EB1）在宮頸組織中的表達及其對自噬標志蛋白LC3和p62/SQSTM1蛋白表達的影響。方法免疫組織化學檢測EB1在宮頸癌、宮頸息肉和慢性宮頸炎組織中的表達；siRNA干擾方法抑制EB1基因表達，并采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測此時宮頸癌Siha細胞自噬標志蛋白LC3和p62/SQSTM1基因的表達。結果EB1的表達部位主要集中在細胞核外周的胞質中。EB1在宮頸癌和宮頸息肉中的陽性表達率顯著低于宮頸慢性炎性組織（P＜0.05），但在陽性表達的宮頸癌組織中，絕大多數間質細胞表現為陰性；EB1在中、低分化宮頸鱗癌組織中的陽性表達率顯著低于高分化宮頸鱗癌組織（P＜0.05）。當EB1基因表達在宮頸癌Siha細胞中的表達被抑制時，無論是在mRNA還是在蛋白水平，自噬標志蛋白p62/SQSTM1和LC3的表達均顯著增加（P＜0.05）。結論EB1在自噬發生較低的宮頸癌組織中陽性表達率低于自噬發生較高的宮頸慢性炎性組織；抑制EB1在宮頸癌Siha細胞中的表達，則自噬標志蛋白p62/SQSTM1和LC3表達改變，這一發現充分證明EB1在宮頸癌的自噬過程中發揮著一定的生物學效應。

末端結合蛋白1（EB1）；宮頸癌；自噬；自噬體；微管

宮頸癌在世界范圍內都是婦女發病和致死的主要原因。雖已確認人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宮頸癌的主要病原體，然而僅僅是該病毒的感染不足以引起癌癥演變。宮頸癌同其他腫瘤［1］一樣，也具有非整倍體和染色體不穩定現象［2］，但最新研究發現，宮頸癌細胞的染色體非整倍體和染色體不穩定與所感染的HPV類型無關［3］，這充分說明宮頸癌的發病機制和其他腫瘤一樣復雜，因此有必要對宮頸癌發生發展的分子機制進行探討。

自噬作為一種進化保守的溶酶體降解途徑，是細胞質中長壽蛋白和細胞器降解的主要方式并通常在癌癥中下調［4］。自噬也因在癌癥發展過程中對非整倍體形成的重要作用［5-6］成為近幾年來腫瘤形成機制和治療的重要研究方向。研究表明，自噬的激活可降低肝細胞癌的基因組不穩定性［7］。抑制上皮細胞中自噬必需基因BECN1和ATG5的表達可引起基因擴增和非整倍體形成［8-9］。這些研究充分展示了自噬在腫瘤發展中非整倍體形成的作用，但具體機制還不清楚。

細胞基因組不穩定性和非整倍體產生的前提依賴微管的動態不平衡［10］。微管末端結合蛋白1（endbinding protein 1，EB1）作為調節微管平衡的關鍵蛋白［11-12］，在高滲誘發的腎近端小管樣細胞LLC-PK1自噬時，與微管的結合頻率增加［13］。另外，抑制Hela細胞中EB1表達可促進染色體分離錯誤而導致非整倍體產生［14］。上述研究結果充分表明了EB1在自噬和非整倍體中的重要作用，但EB1在宮頸癌中的表達鮮有報道，且其在自噬中的具體機制還不清楚。為此，本研究檢測了宮頸癌組織中EB1的表達，并干擾宮頸癌細胞Siha中EB1的表達，以明確自噬標志基因LC3和p62/SQSTM1的表達改變，初步探討EB1在宮頸癌發生發展和自噬中的功能。

材料和方法

標本收集川北醫學院附屬醫院宮頸癌石蠟包埋組織121例，其中鱗癌112例，腺癌9例，年齡中位數為50（33～79）歲；另收集宮頸息肉石蠟包埋組織51例，宮頸炎癥石蠟包埋組織29例。每個組織4μm厚度切片，75℃烤片2h后備用。

宮頸癌Siha細胞株由四川大學華西第二臨床醫學院王和教授惠贈。細胞接種到25mm2培養瓶中，加5mL含10％FBS的DMEM（GIBCO）培養基，37℃、5％CO2培養。待細胞約80％融合后，用0.25％胰酶消化傳代，按1×105細胞復種于6孔板，37℃、5％CO2培養過夜。

免疫組織化學手術切除的標本用100g/L甲醛固定，石蠟包埋，組織切片厚度4μm。免疫組化采用SP法，PBS代替EB1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）作陰性對照。以上實驗步驟按免疫組化試劑盒（北京嘉美生物）說明書的程序進行。EB1表達陽性時呈棕黃色，主要分布于核周胞質中，并按照染色深淺分組：陰性（-）：無染色；弱陽性（+）：淺染色；陽性（++）：中度染色；強陽性（+++）：強染色。

RNAiEB1干擾片段由上海吉瑪制藥技術有限公司設計和合成，EB1干擾片段：正義鏈：5′-GCU-GCGUAUUGUCAGUUUATT-3′，反義鏈：5′-UAAACUGACAAUACGCAGCTT-3′；FAM標記陰性對照片段：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。5×104細胞復種于6孔板，37℃、5％CO2培養過夜。去除原培養液，并用PBS洗2次，按照siRNA操作說明，用無血清培養基配制100pmol的siRNA片段和250μL脂質體2000，37℃、5％CO2培養6h后，熒光倒置顯微鏡下觀察并更換完全培養基繼續培養30h。

實時熒光定量PCR以上6孔板細胞用PBS洗2次，加500μL Trizol，按說明書程序提取總RNA。分光光度計對所提總RNA進行定量和純度鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質量。采用BioBRK Rever Tra Ace以隨機引物為引物逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green適時熒光定量技術對目的基因mRNA進行相對定量檢測。EB1引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司，上游引物：5′-GGATCAATGAGTCTCTGCAGTTG-A-3′，下游引物：5′-GGAGCCAGGGAACAGCAT-G-3′；LC3B引物購自韓國Bioneer公司，上游引物：5′-AATCCCGGTGATCATCGAGC-3′，下游引物：5′-GCCGGATGATCTTGACCAAC-3′；p62/SQSTM1引物也購自韓國Bioneer公司，引物號為8878，以βactin為內對照（引物購自上海生工），上游引物：5′-TCCCTGGAGAAGAGCTAC-GA-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGT-ACAG-3′。反應體系為20μL，取樣本cDNA 2μL、上游和下游引物各0.25μL，加入試劑盒其他成分。反應條件如下：94℃10min 1個循環，94℃15s、60℃1min、40個循環，全程采集熒光。數據以2-ΔΔCt表示。

Western blot6孔板細胞用PBS洗2次，0.25％胰酶消化收集細胞，PBS洗1遍后，加入50μL RIPA裂解液裂解細胞，10 080×g離心15min，上清液分裝，-80℃保存備用。取等量蛋白（約30μg）經15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至0.2μm孔徑的PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉后，加入EB1（美國Santa Cruz公司）、LC3B或p62/SQSTM1（美國Cell Signaling Technology公司），其中EB1以1∶200稀釋，后兩者均以1∶1 000稀釋，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（均為1∶3 000），室溫孵育1h，洗膜后采用電化學發光顯影成像。

統計學處理采用SPSS Statistics 19.0統計軟件分析，計數資料（免疫組織化學陽性率）采用χ2檢驗；計量數據符合正態分布故以xˉ±s表示，兩組間均值比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

EB1在宮頸組織中的表達EB1主要在宮頸組織細胞核周胞質中表達，隨著陽性表達增強，甚至在胞核中也表現為陽性（圖1）。免疫組織化學結果顯示，EB1在宮頸鱗癌、腺癌和息肉組織中的陽性率分別為59.8％、55.6％和66.7％，顯著低于宮頸炎性組織的93.1％，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。在絕大多數陽性表達的宮頸癌組織中，雖然癌細胞表現為陽性，但正常間質細胞為陰性（圖2）。EB1在高分化宮頸鱗癌組織中陽性率顯著高于中、低分化宮頸鱗癌組織（P＜0.05，表2）。

圖1 EB1在中分化宮頸鱗癌組織中的免疫組織化學結果（×400）Fig 1 Results of EB1 protein expressions in middle differentiation cervical squamous carcinoma tissues detected by immunohistochemical method（×400）

EB1被抑制時自噬標志蛋白的表達本實驗采用siRNA方法干擾EB1基因在宮頸癌Siha細胞中的表達，實驗結果表明，當轉染6h后，大于90％的細胞檢測到熒光信號（圖3）。當轉染36h時，無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，EB1的表達均顯著低于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4A、D）。此時，自噬標志蛋白LC3和p62/SQSTM1在mRNA水平和蛋白水平均顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4B-D）。

表1 EB1在宮頸組織中的表達Tab 1 The expressions of EB1 protein in cervical tissues （％）

圖2 宮頸癌陽性表達時EB1在癌細胞和間質細胞中的表現差異（×400）Fig 2 The difference of EB1 performed in cancer cells and interstitial cells when it was positively expressed in cervical cancers（×400）

表2 宮頸鱗癌EB1表達與病理分化關系Tab 2 The relationbetween EB1 expression and the pathological differentiation of cervical squamous carcinomas （％）

討論

多個研究采用免疫組織化學和高通量方法證實了EB1在多種癌癥組織中的陽性率明顯高于正常組織［15-17］。在本研究中，我們發現EB1在宮頸癌組織中的陽性表達率約為60％，與其他腫瘤基本相同［15］。因為倫理學原因本研究沒有收集到正常宮頸組織作為對照，因此無法判斷宮頸癌組織和正常組織中EB1表達的高低，但我們發現在EB1陽性的宮頸癌組織中，絕大多數正常間質細胞沒有被檢測到陽性棕色顆粒，側面反映了宮頸癌組織中EB1表達可能高于正常宮頸組織。另外，本次實驗結果還顯示，EB1在宮頸息肉和宮頸癌這兩種增生性組織中的陽性表達相當，這很可能與EB1對β-catenin/TCF通路的調節而促進細胞生長相關［15，18］。本研究還發現，EB1在宮頸炎性組織中的陽性率高達90％以上，明顯高于宮頸癌組織。顯然，單從EB1促進細胞生長功能不足以解釋這一現象。是否因為在宮頸癌組織中細胞自噬降低［19］，而在炎性組織中自噬增加［20-21］有關？EB1又在自噬過程中起到什么功能？

自噬可對細胞內病原體、炎性小體、細胞因子和功能退化的細胞器（如線粒體）進行隔離和降解［22］。自噬由膜囊隔離細胞組分（稱為吞噬泡）開始，隔離膜融合而形成雙分子層膜囊泡而稱為自噬體［23］。接著自噬體朝溶酶體靶向運動，自噬體的外層膜與溶酶體/空泡融合，釋放單分子層的囊泡（自噬小體）到溶酶體/空泡而形成自噬溶酶體。最后，被隔離的內容物和內膜被溶酶體水解酶降解。最近研究表明，自噬需要微管的參與［13］。Zhu等［24］在研究中報道，自噬標志蛋白LC3在宮頸鱗癌組織的表達增加，雖然同患者年齡、臨床分期、病理分化和淋巴結轉移無關，但發現高表達的腫瘤患者3年生存率明顯高于低表達患者。一般情況下，病理分化與預后呈正相關，本研究結果顯示，宮頸鱗癌的分化程度越高，EB1的陽性率越高，這也暗示EB1具有促進自噬發生的可能。

圖4 EB1、LC3和p62/SQSTM1mRNA和蛋白表達結果Fig 4 The levels of m RNA and protein of EB1，LC3 and p62/SQSTM1

為了證實這一假設和基于宮頸癌染色體異常類型與感染HPV病毒類型無關［3］的理論，在本研究中我們選取高危HPV16型的宮頸癌Siha細胞作為進一步研究對象。通過RNAi方法抑制EB1在Siha細胞中的表達，并檢測此時自噬標志蛋白LC3和p62/SQSTM1的表達［25］。結果發現，在有效抑制EB1表達時，LC3 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白均顯著增加。LC3之所以為自噬的標志蛋白是因為它能特異性摻合到自噬泡中［26-28］，而單純檢測LC3不足以判斷自噬是否發生，自噬體與溶酶體融合阻斷或抑制溶酶體介導的蛋白水解時LC3-Ⅱ生成也可增加［25］。因此我們還對另一種自噬標志蛋白p62/SQSTM1進行了檢測。p62/SQSTM1是自噬的底物［29］，也具有激活哺乳動物雷帕霉素靶標（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑的作用［30，31］而抑制細胞自噬，因此也成為監控自噬體與溶酶體融合和降解的分子標志。我們發現在EB1表達受抑制時，p62/SQSTM1 mRNA和蛋白水平也都顯著增加。這些結果表明抑制EB1，很可能是因為EB1對微管穩定性維持和促使微管正端組裝［32］受阻而阻斷自噬體的運輸以及隨后發生的與溶酶體融合和降解從而抑制自噬的發生，導致LC3和p62/SQSTM1兩者表達均增加。同樣也印證了高自噬發生的宮頸炎性組織中EB1表達增加的結果；高分化宮頸癌組織EB1表達增加還預示著自噬發生增加的可能性。

綜上所述，EB1在自噬發生較低的宮頸癌組織中的表達低于自噬發生較高的慢性宮頸炎性組織中的表達。根據文獻報道EB1在腫瘤組織較正常組織高表達和本研究中宮頸癌細胞陽性的組織中間質細胞為陰性表現，推斷EB1在染色體異常的宮頸癌組織中的表達可能高于正常組織。推測EB1的高表達具有維持染色體異常的癌癥組織的穩定分裂而促進細胞增殖的作用，而更高表達則可能誘發細胞自噬發生的可能。EB1在染色體分離和自噬過程中的雙重功能值得我們進一步探索。

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The expression of end-binding protein 1（EB1）in cervical tissues and its effect on the expressions of autophagic biomarkers

ZHU Xing-chun1，2，LIU Qing-song2，YANG Hui-min3，FANG Ding-zhi1△
（1Department of Btochemtstry and Molecular Btology Laboratory，West Chtna College of Bastc and Forenstc Medtctne，Stchuan Untverstty，Chengdu610041，Stchuan Provtnce，Chtna；2Department of Laboratory Medtctne，Afftltated Hospttal of Northern Stchuan Medtcal College，Nanchong637000，Stchuan Provtnce，Chtna；3Department ofPathology，Northern Stchuan Medtcal College，Nanchong637007，Stchuan Provtnce，Chtna）

ObjectiveTo investigate the expression of end-binding protein 1（EB1）in cervical tissues and its effect to the expressions of autophagic biomarkers，LC3 and p62/SQSTM1.MethodsThe expression of EB1 protein in cervical carcinoma，cervical polyps and chronic cervicitis tissues was detected by mmunohistochemical method.The expression of EB1 in cervical cancer Siha cells was knocked down by siRNA，and then the expressions of autophagic biomarkers，LC3 and p62/SQSTM1 were detected by realtime fluorescent quantitative PCR and Western blot.ResultsThe EB1 mainly located on the cytoplasm which embraces peripheral of nucleus.The positive expression rate of EB1 in cervical cancer and cervical polyps tissues was significantly lower than those in cervical tissues of chronic inflammation（P＜0.05），butthe vast majority of interstitial cells were negatively expressed of EB1 in the EB1 positive expression cervical cancer tissues.The positive expression rate of EB1 in middle and low differentiation cervical squamous cell carcinoma tissues was significantly lower than that of high differentiation squamous cell carcinoma tissues（P＜0.05）.When the expression of EB1 was knocked down in cervical cancer Siha cells by siRNA，the expression of autophagic biomarkers，p62/SQSTM1 and LC3，were significantly increased at both mRNA level and protein level（P＜0.05）.ConclusionsEB1 in cervical cancer tissues whose autophagy is suppressed is lower expressed than in cervical chronic inflammation tissues whose autophagy is activated.Both p62/SQSTM1 and LC3，the autophagic biomarkers，are dramatically increased in cervical cancer Siha cells when the EB1 expression was suppressed，which indicates EB1 plays a role in autophagy of cervical carcinoma.

end-binding protein 1（EB1）；cervical cancer；autophagy；autophagosome；microtubule

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.05.012

△Corresponding author E-mail：dzfang@scu.edu.cn

2013-11-29；編輯：沈玲）