鐵羧葡胺磁化標記大鼠骨髓間充質干細胞的有效性及安全性研究

李冰玉 沈運麗 黃浙勇 孫愛軍 錢菊英 鄒云增 葛均波

(1.復旦大學附屬中山醫院a實驗室，b心內科，上海 200032；2.同濟大學附屬東方醫院心內科，上海 200120)

干細胞移植是治療全身退行性疾病、細胞壞死性疾病的新興方法。近年來，超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)標記干細胞的技術已經被用于細胞磁共振活體示蹤和細胞磁靶向研究，成為探索細胞移植機制和改善療效的有力工具。目前，SPIONs研究大多采用Ferumoxides(商品名：Feridex)標記細胞，而關于鐵羧葡胺(SHU555A，商品名為Resovist)的研究較少。本實驗旨在探究Resovist標記大鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的有效性及安全性，為細胞磁靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑及儀器設備 DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，Resovist購自德國Schering公司，非特異性轉染劑多聚賴氨酸(PLL，分子量為275 kDa)、磷酸二胺(DAP)、亞鐵氰化鉀、中性紅、PKH26購自美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane公司，多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海鈺森生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。水浴箱購自德國Hettich公司，倒置相差顯微鏡(型號：TS100)購自日本Nikon公司，透射電鏡(型號：CM120)購自荷蘭Philips公司，美國Thermo公司E.IRIS Duo ICP發射光譜儀，多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司，CASY分析儀購自德國Model TT公司，釹鐵硼圓柱體永磁鐵(直徑8 mm，中心表面磁感應強度為0.6 T)。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分離培養 雄性SD大鼠，體質量80 g，頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡5～8 min。在超凈臺內，剪開大鼠腿部及上肢皮膚，分離腿部及上肢肌肉，取出股骨、脛骨和肱骨，于股骨、脛骨和肱骨1/2處剪斷，暴露骨髓腔，用低糖DMEM液緩慢沖出骨髓腔中的細胞，將細胞懸液移入離心管，1000 r/min離心5 min，棄上清液，將沉淀細胞用含6%～10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養液混懸，接種于25 cm2培養瓶內培養。原代細胞培養24 h半量換液，培養48 h全量換液；棄未貼壁細胞，培養72 h再次全量換液，以后每48 h全量換液；待細胞匯合度至80%～90%，消化、計數，按5×104/cm2的細胞密度接種和傳代培養；2～3 d后細胞融合度達90%左右，反復傳代擴增[1-2]。取第3代細胞用作實驗。

1.3 細胞磁標記法 將SPIONs與PLL按100∶3比例用無血清的DMEM培養液稀釋，制成終濃度為50∶1.5 μg /mL的SPIONs-PLL標記培養液，室溫下輕搖混合60 min，然后將其加入MSCs的培養板，于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中孵育24 h，完成磁化標記[1]。

1.4 細胞標記效率檢測 (1)普魯士藍染色：細胞沉淀經PBS洗滌3次后，用4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗滌3次；Perl反應液[2%K3(CN)6+6%HCL]中作用30 min，蒸餾水洗滌3次；1%核固紅復染3 min，蒸餾水洗去多余的核固紅，顯微鏡下觀察；(2)電鏡檢查：用胰蛋白酶溶液消化SPIONs-PLL復合物標記的MSCs，離心，棄上清液，加入2.5%戊二醛溶液、1%鋨酸后固定30 min，用0.5%醋酸鈾染色過夜，脫水，包埋，40℃烤箱放置12 h，60℃聚合24 h。用超薄切片機進行超薄切片，切片厚度為100 nm，并以200目銅網支持組織，用醋酸鈾染液和硝酸鉛染液分別電子染色30 min，在透射電鏡下觀察細胞的超微結構并攝影；(3)細胞鐵濃度測定：取1×105個細胞，離心沉淀，于110℃干燥過夜，加入500 μL高氯酸-硝酸混合物，60℃消化3 h以上，應用原子吸收分光光度儀測定鐵離子濃度，每種條件下均測定3個樣品。

1.5 細胞增殖和活力試驗 將細胞分為4組：未暴露于磁場的未磁化標記MSCs(MSCs)、暴露于磁場的未磁化標記MSCs(Mag-MSCs)、未暴露于磁場的磁化標記MSCs(SPIONs-MSCs)和暴露于磁場的磁化標記MSCs(Mag-SPIONs-MSCs)。磁場暴露是指在75 cm2細胞培養瓶底部放置8 mm的釹鐵硼圓柱體永磁鐵24 h。增殖試驗中，細胞密度為3×105/瓶，每3 d換培養液，待細胞匯合度至90%時，消化并進行細胞計數[3]。細胞活力根據ECE方法應用CASY2 分析儀檢測[4]。所有試驗均重復3次。

2 結 果

2.1 大鼠MSC的分離培養 大鼠骨髓液接種24 h時即有少量細胞貼壁生長，呈卵圓形及細小梭形；48～72 h后貼壁細胞伸展；3～4 d后出現較大的克隆，呈集落生長，為形態均一的梭形細胞；經5～7 d細胞匯合度至80%～90%。傳代細胞生長旺盛時呈漩渦樣，排列有極性，平均每2～3 d即可傳代，見圖1。

A～E分別為大鼠骨髓MSCs原代培養24、48、72、96和120 h；F～H分別為第1、2、3代細胞

2.2 MSCs的標記效率 大鼠MSCs經Resovist標記后，普魯士藍染色顯示細胞內均可見大量著色(藍色)顆粒，標記率接近100%，見圖2A。電鏡檢查顯示，未標記的MSCs細胞胞質內未見致密顆粒囊泡，標記的MSCs細胞胞質內可見大小不一的含鐵致密顆粒囊泡，見圖2B。電鏡下觀察細胞微細結構(細胞和亞細胞水平)，未見氧化鐵的破壞和毒性作用。50∶1.5 μg/mL Resovist-PLL標記MSCs 24 h后，應用原子吸收分光光度法測定大鼠MSCs鐵含量，為(21.77±3.62)pg。

2.3 MSCs標記和外加磁場的細胞毒性 以MSCs的細胞增殖能力為1，Mag-MSCs、SPIONs-MSCs和Mag-SPIONs-MSCs的相對細胞增殖能力分別為1.07+0.05、1.07+0.08和1.05+0.04，組間比較差異無統計學意義(P均<0.05)。以MSCs的細胞活力為1，Mag-MSCs、SPIONs-MSCs和Mag-SPIONs-MSCs的細胞活力比分別為1.030+0.029、1.011+0.021和1.018+0.024，組間比較差異均無統計學意義(P<0.01)，見圖3。結果提示，MSCs標記和外加磁場對細胞增殖能力、細胞活力均無明顯影響。

圖2 普魯士藍染色(A)和電鏡觀察(B)Resovist標記的大鼠MSCs

圖3 Resovist標記和外加磁場對細胞增殖能力(A)和細胞活力(B)的影響

3 討 論

近年來，SPIONs標記干細胞的技術發展迅速，最早主要被用于細胞磁共振顯像和活體示蹤的動物和臨床研究。由于SPIONs具有超順磁性，因此SPIONs標記的細胞具有磁響應性，本課題組前期研究[1]和國外研究[5]均發現，磁場能促進SPIONs負荷細胞的定向運動。關于心肌梗死的細胞治療的研究顯示，磁靶向可顯著增加細胞的短期停留，減輕左室重塑，改善心功能[6-8]。因此，磁靶向引導下細胞治療有望成為促進移植細胞歸巢的新手段，具有潛在的應用前景。

目前SPIONs種類繁多，國內外研究較多的為Feridex，而關于Resovist研究較少。Resovist(直徑62 nm)作為內皮網狀系統的磁共振對比劑，在部分歐洲國家已被批準臨床應用，在我國已完成Ⅲ期臨床試驗(復旦大學附屬中山醫院等)。本研究以Resovist-PLL標記大鼠骨髓MSCs，發現終濃度為50∶1.5 μg/mL的Resovist-PLL作用24 h后能使細胞鐵含量達(23.77±2.06)pg/細胞，而對細胞活力和增殖能力無明顯影響，提示Resovist-PLL能高效標記大鼠骨髓MSCs，具有實驗和臨床應用潛力。Resovist具有生物可降解性，進入人體后能被細胞代謝，進入正常血漿鐵池代謝過程。研究[9-10]表明，臨床批準的SPIONs制劑對標記細胞的存活、代謝活性、增殖、凋亡、分化、活性氧形成等方面幾乎沒有不良影響。Arbab等[11]觀察不同包被、直徑和濃度的SPIONs(17～65 nm碳氧葡聚糖或150 nm葡聚糖包被，培養液鐵濃度0.01～1.0 mg/mL)、加用或不加用脂質體時對人腫瘤細胞的標記效率，結果發現大直徑SPIONs顆粒(65 nm)比小直徑(17 nm)SPIONs能顯著增加鐵攝取[(4.37±0.08)μg Fe/105細胞 比(2.14±0.06)μg Fe/105細胞]。本研究中所用的Resovist顆粒直徑60 nm，大于Feridex(直徑50 nm)，更有利于細胞攝取。

氧化鐵顆粒因葡聚糖羧基而帶負電荷，與細胞相互排斥，難以有效標記非吞噬性的干細胞或其他哺乳細胞。PLL等轉染劑為帶正電荷(2～48 mV)的大分子物質，最早用于轉染DNA到細胞核，可通過靜電作用包裹氧化鐵顆粒，易于被細胞內吞攝取，具有簡便、安全、高效、非特異等特點。由于游離狀態的PLL有細胞毒性，并與濃度正相關，所以確定合適的Fe-PLL比例十分重要，一方面要保證形成穩定的、有較高標記效率的復合物，另一方面要盡量減小游離PLL的細胞毒性。一般認為，Fe和PLL的比例為100∶3時能兼顧高轉導效率和低毒性，因此本研究選擇100∶3的比例。

在細胞磁靶向研究中，外加磁場和細胞磁感應性是研究的關鍵要素。本研究在證實細胞磁化標記效率的基礎上，也探討了外加磁場對磁化細胞的影響。結果顯示，0.6 T釹鐵硼圓柱體永磁鐵暴露24 h對細胞的活力和增殖沒有明顯影響。由于目前磁導向細胞移植研究均采用永磁體，磁場強度與本研究采用的相近[12-13]，因此，本研究結果對動物實驗研究有一定的指導價值。

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