上皮性卵巢癌組織中胰島素樣生長因子1及其相關蛋白的表達分析

賀樂奇 申春梅 王龍武

(1.復旦大學附屬上海市第五人民醫院檢驗科，上海 200240；2.長沙醫學院附屬第一醫院檢驗科，湖南長沙 410129)

卵巢癌是女性生殖系統常見的三大惡性腫瘤之一，早期診斷較為困難，大部分患者明確診斷時已處晚期。近年來，生長因子與腫瘤的關系備受矚目。研究[1-2]發現，胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)在腫瘤細胞的增殖和分化過程中起重要的調控作用，可以介導腫瘤細胞中的多條信號轉導通路，直接影響細胞的有絲分裂、分化、代謝、遷移、凋亡等。本研究探討了上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)組織中的IGF-1、IGF-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R) 和胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)的表達水平及臨床意義，以期為EOC的早期診斷、治療以及預后判斷提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009—2012年在上海市第五人民醫院及江蘇省南通市腫瘤醫院行手術治療的EOC患者45例，年齡33～75歲，中位年齡55歲；選取同期在這兩所醫院治療的非EOC患者25例(因子宮肌瘤等疾病而需行子宮及附件切除術的患者)，年齡25～65歲，中位年齡47歲。所有患者均經組織病理學檢查明確診斷。將術中切除的新鮮組織迅速放入液氮中保存。

1.2 試劑 Trizol試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒均購自日本寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設計 采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。4種基因的引物序列見表1。

1.4 方法

1.4.1 總RNA的提取與逆轉錄 將50～100 mg液氮保存的新鮮組織在液氮中研磨成粉末，加入1 mL Trizol，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。檢測提取后的總RNA的濃度和純度，取A260/A280為1.8～2.0的樣品0.8 μg，按逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為cDNA， 于-20 ℃保存。

1.4.2 PCR 采用20 μL反應體系，反應條件如下：IGF-1和IGF-1R為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，共40個循環; IGFBP3和β-actin為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個循環；然后再進行熔解曲線分析。每次試驗均設陰、陽性及空白對照，同時進行復孔檢測，取平均值進行計算。

根據擴增曲線和熔解曲線分析結果，取閾值(cycle threshold，Ct)，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達水平[3]。計算IGF、IGF-1R 及IGFBP3 的mRNA相對含量，公式為：目的基因mRNA/β-actin mRNA=2-(目的基因mRNA Ct-β-actin mRNA Ct)，Ct值為2次擴增的均值，Ct值>38時判斷為陰性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 15.0軟件進行統計學處理，mRNA相對表達量的數據呈偏態分布，采用M(P25～P75)表示；多組間比較采用非參數檢驗的Kruskal-Wallis H檢驗；組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在EOC和正常卵巢組織中的mRNA表達情況 EOC組織中IGF-1、IGF-1R和IGFBP3的 mRNA相對表達量均高于正常卵巢組織，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3 的mRNA表達水平與EOC臨床病理學指標之間的關系 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在EOC組織中的mRNA相對表達量在不同年齡組、不同臨床分期患者之間差異均無統計學意義(P>0.05)；這3個基因在有淋巴結轉移的患者中的相對表達量明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異有統計學意義(P<0.05)；這3個基因的表達與EOC組織的分化程度相關，IGF-1和IGF-1R的mRNA相對表達量隨EOC分化程度的降低而增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，IGFBP3的相對表達量隨分化程度的降低而減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在上皮性卵巢癌和正常卵巢組織中的mRNA相對表達量 [M(P25～P75)，×10-3]

表3 IGF-1、IGF-1R和IGFBP3在不同類別EOC患者中的mRNA相對表達量[M(P25～P75)，×10-3]

3 討 論

IGF具有胰島素樣的促代謝作用。IGF系統包括2個多肽類生長因子IGF-1、IGF-2，2類受體IGF-1R、IGF-2R，至少6種對IGF有高親和力的IGFBP以及IGFBP蛋白酶[4]。IGF-1的編碼基因位于12號染色體，是由70個氨基酸組成的單鏈多肽。IGF-1的主要功能是介導生長激素的促生長作用，且受生長激素的調節，IGF-1廣泛分布于卵巢、輸卵管、子宮內膜和胎盤等組織中。IF-1R是由2個α亞基和2個β亞基組成的四亞基糖蛋白，對細胞的正常增殖、凋亡過程以及機體的生長過程具有調節作用[5]。近年來發現，IGF系統在腫瘤的發生發展過程中也起重要作用。

多種腫瘤細胞均能產生和分泌IGF。IGF可以作為促有絲分裂原誘導細胞內原癌基因的表達，啟動細胞增殖分裂過程并抑制細胞凋亡[6]。研究[2]表明，IGF-1R與癌細胞的增殖、轉化、轉移有關。本研究發現， IGF-1和IGF-1R 在EOC組織中的mRNA水平均高于正常卵巢組織，且兩者的表達水平與腫瘤的分化程度及轉移相關。在IGF-1信號轉導通路中，IGF-1R的活性調節是一個關鍵點，研究[7-8]表明，反義寡核苷酸或IGF-1R抗體均能明顯抑制IGF-1R的活性，從而抑制EOC腫瘤細胞的有絲分裂及其抵抗凋亡的能力。研究[9]發現，抑制IGF-1R信號轉導通路可減少腫瘤細胞的轉移，表明IGF-1、IGF-1R在腫瘤的發生發展中起重要作用，IGF-1、IGF-1R信號通路的調控有望成為腫瘤治療的一個新的研究方向[10]。

IGFBP主要由肝臟合成，分布于各種組織和體液中，通過調控游離IGF的含量來調節IGF的生物活性[11]。正常人體血清中含量最高的IGFBP為IGFBP3，它能結合血清中絕大部分IGF-1，保護IGF-1不被迅速降解并將其運輸至不同部位；可以調控IGF-1與受體之間的相互作用，從而調控細胞的生長和凋亡。但若IGFBP3過度表達，則可以誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長[2]。本研究發現， EOC中IGFBP3 mRNA 水平較正常卵巢組織顯著升高，且其升高程度與腫瘤細胞的分化程度正相關，提示IGFBP3還可通過不依賴于IGF-1的方式發揮作用，這與閆曉娟等[11]的報告相同。

IGF可以通過旁分泌和(或)自分泌方式生成，其生物學功能最終取決于IGF、IGFR和IGFBP等分子之間的綜合作用[12]。本研究表明，IGF-1、IGF-1R、IGFBP3參與了EOC的發生發展過程，其表達程度與腫瘤細胞的分化、轉移相關，這為深入研究EOC組織中IGF系統的調控機制提供了依據。

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