α-輔肌動(dòng)蛋白4對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響及其機(jī)制

朱琳艷 張蓉

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123；2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201499)

卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤。約75%的卵巢癌患者確診時(shí)已為晚期，而Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者的5年生存率不足45%[1]。化療是晚期卵巢癌的主要治療手段之一。α-輔肌動(dòng)蛋白4(alpha-actinin 4，ACTN4)是一種纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)交聯(lián)蛋白，是血影蛋白超家族成員之一，可參與細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)變化、胞質(zhì)分裂及細(xì)胞黏附，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲[2]。本研究以ACTN4高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3和OVCA429)為研究對(duì)象，探究體外沉默ACTN4表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡及化療敏感性的影響及其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，RPMI-1640和McCoy’s 5A培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素混合液(青霉素的含量為10 kU/mL，鏈霉素的含量為10 mg/mL)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，紫杉醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine TM 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，real-time PCR試劑盒購(gòu)自丹麥DBI公司，蛋白裂解液(RIPA)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3及人卵巢漿液性癌細(xì)胞株OVCA429細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。SKOV3細(xì)胞采用含10% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，OVCA429細(xì)胞采用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，均置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 靶向ACTN4基因的ACTN4-siRNA的設(shè)計(jì)與合成 靶向ACTN4基因的干擾序列 正義鏈：5′-GAUGGUAUGGACGAUGAACTT-3′，反義鏈：5′-GUUCAUCGUCCAUACCAUCTT-3′。另設(shè)計(jì)一條無(wú)義序列作為陰性對(duì)照siRNA，正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 ACTN4-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SKOV3/OVCA 429細(xì)胞 按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM 2000說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3/OVCA429細(xì)胞(5×105/孔)，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后細(xì)胞融合至30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將ACTN4-siRNA寡聚物100 pmol加至100 μL Opti-MEM無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中輕輕混勻，室溫放置5 min；再加入5.0 μL Lipofectamine TM 2000，輕輕混勻后，室溫下孵育5 min；將上述混合物加到培養(yǎng)板中，再補(bǔ)加900 μL無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱孵育6 h后換完全培養(yǎng)基。每種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置均為：未轉(zhuǎn)染組(空白組)、陰性對(duì)照組(對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Ctrl-siRNA)和ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA)

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)ACTN4 mRNA的表達(dá) 提取卵巢癌細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并擴(kuò)增目的片段。ACTN4基因引物序列：上游引物5′ -GCAGCATGGGCGACTACAT-3′，下游引物5′-TTGAGCCCGTCTCGGAAGT -3′。內(nèi)參18s RNA 基因引物序列：上游引物5′ -TGCGAGTACTCAACACCAACA-3′，下游引物5′- GCATATCTTCGGCCCACA-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-△△ct值表示ACTN4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量并計(jì)算蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST(Trisbuffered saline with Tween)洗滌3次，滴加一抗(兔抗人ACTN4多克隆抗體1∶2000稀釋，兔抗人AKT/p-AKT、Src/p-Src、FAK/p-FAK、Bax、Bad、Bid、 Bim、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體為1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜后，用TBST洗膜，滴加二抗(鼠抗兔熒光二抗，1∶10000稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜，以GAPDH作為內(nèi)參照。采用ImageJ軟件分析圖像，以ACTN4蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶密度積分的比值表示ACTN4蛋白水平。

1.2.6 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，按2000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到4塊96孔板中，每種細(xì)胞接種5個(gè)復(fù)孔。每天取1塊板，加入含有10% MTT的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚；震蕩后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm處的吸光值(OD值),并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.7 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染后24 h棄去培養(yǎng)基，按濃度梯度(0、5、10、20、40、80 nmol/L)加入紫杉醇，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；加入紫杉醇48 h后棄去培養(yǎng)液，進(jìn)行MTT試驗(yàn)，檢測(cè)OD值(方法同1.2.6)，計(jì)算細(xì)胞抑制率及存活率，并繪制細(xì)胞存活率曲線。細(xì)胞抑制率(%)=(陰性對(duì)照組OD值-轉(zhuǎn)染組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%，細(xì)胞存活率(%)=100%-細(xì)胞抑制率(%)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡情況 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，PBS洗3次，按照Annexin V-FITC和PI雙染試劑盒說(shuō)明書用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，用未染色的細(xì)胞調(diào)零，以Annexin V-FITC和PI單染管作為基準(zhǔn)，獲取參數(shù)并分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可下調(diào)SKOV3/OVCA429細(xì)胞中ACTN4基因的表達(dá) real-time PCR及Western blotting結(jié)果顯示，ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)ACTN4的SKOV3/OVCA429細(xì)胞后，ACTN4 mRNA表達(dá)水平分別下調(diào)了82.4%、73.9%；蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)86.7%、78.2%。與空白組相比，陰性組Ctrl-siRNA-SKOV3/OVCA429中ACTN4 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA對(duì)SKOV3/OVCA429細(xì)胞增殖能力的抑制作用 MTT結(jié)果提示，SKOV3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組第1天OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第2天對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組OD值分別為1.28±0.10和0.87±0.07，第3天的OD值分別為1.68±0.13和1.18±0.07，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 ) 。OVCA429細(xì)胞轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組在第1天OD值分別為0.59±0.05和0.43±0.05，第2天OD值分別為1.04±0.10和0.63±0.09，第3天OD值分別為1.40±0.12和0.99±0.08；兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染可增加SKOV3/OVCA 429細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性 MTT結(jié)果顯示，ACTN4-siRNA和Ctrl-siRNA分別轉(zhuǎn)染SKOV3/OVCA429細(xì)胞，然后用不同濃度紫杉醇處理，48 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度值并計(jì)算不同濃度紫杉醇處理的細(xì)胞存活率。兩種細(xì)胞的結(jié)果一致，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率均較低，轉(zhuǎn)染組對(duì)紫杉醇的敏感性明顯增加(P<0.01，圖2A、B)。各組細(xì)胞存活率數(shù)值詳見(jiàn)表1。

2.4 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染可促進(jìn)SKOV3和OVCA429細(xì)胞的凋亡 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA 48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3/OVCA429細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染組凋亡率[(7.22±0.31)%]明顯高于對(duì)照組[(2.07±0.08)%]；OVCA429細(xì)胞轉(zhuǎn)染組凋亡率[(23.37±0.18)%]明顯高于對(duì)照組[(19.49±0.19)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A：卵巢癌細(xì)胞中ACTN4的表達(dá)情況；B、C ：SKOV3/OVCA429中ACTN4的mRNA表達(dá)情況；D、E：Western blotting檢測(cè)SKOV3/OVCA429中ACTN4的表達(dá)情況

表1 各轉(zhuǎn)染組的SKOV3/OVCA429細(xì)胞在不同濃度紫杉醇作用下的細(xì)胞存活率 (%)

圖2 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可增加卵巢癌細(xì)胞SKOV3/OVCA429對(duì)紫杉醇的化療敏感性

2.5 ACTN4-siRNA轉(zhuǎn)染后SKOV3/OVCA429細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá) Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA后SKOV3/OVCA429細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白分子的表達(dá)，結(jié)果顯示，沉默ACTN4基因后，p-Akt、p-FAK蛋白表達(dá)明顯降低(圖4A)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，促凋亡蛋白Bid和Bim表達(dá)水平明顯升高，見(jiàn)圖4B。

圖3 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3/OVCA429的凋亡

圖4 轉(zhuǎn)染ACTN4-siRNA后SKOV3/OVCA429細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

目前，卵巢癌的早期診斷及判斷復(fù)發(fā)的主要標(biāo)志物為CA125，但其靈敏度和特異度均不滿意，因此尋找新的卵巢癌標(biāo)志物十分重要[2]。我們前期通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ACTN4在卵巢癌患者中表達(dá)上調(diào)，且ACTN4基因與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)。

雖然目前臨床上80%的卵巢癌患者首次化療時(shí)對(duì)紫杉醇敏感，但大部分復(fù)發(fā)患者再次化療時(shí)對(duì)紫杉醇的敏感性大大降低。本研究中，特異性干擾ACTN4表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞增殖的能力明顯減弱，卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾ACTN4表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡率明顯升高，提示ACTN4可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而參與化療耐藥。

Bansal等[3]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性與凋亡抑制蛋白家族Bcl-2的表達(dá)密切相關(guān)，其中Bcl-2家族中的Bad蛋白與上皮性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥有關(guān)。Yousif[4]發(fā)現(xiàn)，抑制FAK的表達(dá)可降低p-PI3K/p-Akt的表達(dá)水平；Dent等[5]證實(shí)，卵巢癌中PI3K/Akt的活化與腫瘤的惡性行為及抗凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾ACTN4的表達(dá)后，p-Akt/p-FAK表達(dá)降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bid和Bim表達(dá)升高，這提示，ACTN4可能通過(guò)激活FAK-PI3K/Akt通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，從而抵抗化療。

綜上所述，ACTN4可能通過(guò)激活FAK-PI3K/Akt信號(hào)通路抑制Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bid和Bim的表達(dá)，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。干擾ACTN4的表達(dá)可增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性，有望改善卵巢癌患者的預(yù)后。

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