exendin-4類似物EW的降糖活性的研究

唐玲 陸怡 吳曉琰

(1.上海市北站醫院內科，上海 200070；2.復旦大學附屬華山醫院老年科，上海 200040)

中華醫學會糖尿病學會2007年6月—2008年5月的一項全國性橫斷面調查研究[1]發現，我國糖尿病患者達9200萬，20歲以上人群中年齡標化的糖尿病患病率高達9.7%，其中2型糖尿病占90%以上。據英國前瞻性糖尿病研究(UK prospective diabetes study，UKPDS)、糖尿病心血管風險控制行動(action to control cardiovascular risk in diabetes，ACCORD)及糖尿病和心血管病行動(action in diabetes and vascular disease，ADVANCE)報道，常用的6大類治療糖尿病的藥物(雙胍類、磺脲類、格列奈類、噻唑烷二酮類、α-糖苷酶抑制劑及胰島素)均不能長期有效地降低血糖，也不能阻止2型糖尿病及其并發癥的進展[2-3]。此外，這些降糖藥物的安全性也尚待闡明。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由小腸黏膜分泌的多肽，多肽長30個氨基酸，餐后其在血清中的濃度迅速增高，半衰期1.5～2.1 min[4]。GLP-1對2型糖尿病患者有以下作用：血糖依賴性地刺激胰腺β細胞分泌胰島素；增加胰腺β細胞體積；抑制胰腺α細胞分泌胰高血糖素及中樞性抑制食欲等。GLP-1由血漿中的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)酶解，由腎臟及其他蛋白酶如人中性內肽酶24.11(neutral endopeptidase 24.11，NEP24.11)酶解清除，前者是主要途徑[5]。GLP-1受體途徑治療是目前治療糖尿病的新途徑[5-9]。GLP-1受體途徑藥物包括GLP-1受體激動劑及DPP4酶抑制劑。

GLP-1受體激動劑exendin-4含39個氨基酸，與GLP-1受體結合并激活受體，模擬GLP-1的功能。其N端的序列是His、Gly，能夠抵抗DPP4，半衰期3～5 h，是中效的抗糖尿病藥物，具有良好的降糖作用，可單獨應用或與其他口服抗糖尿病藥物及胰島素聯用[10-15]。GLP-1還可使體質量持續減輕，并有助于改善多項心血管危險因素[16]。由于exendin-4較人源GLP-1的末端肽鏈延長了9個氨基酸，故有免疫源性，40%～50%患者注射后可在血漿中檢測到不同滴度的抗體[17]。

Wu等[18-19]設計了一種新的exendin-4類似物EW(PCT/CN2009/001321)， 飛行質譜(MALDI-MS)分析證明符合設計，并在小鼠體內初步證實了其降糖活性。本研究旨在進一步研究EW的降糖活性及安全性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠(雄性，8周，體質量約20 g)；db/db小鼠(雄性，8周，體質量約40 g)及昆明鼠(雄性，8周，體質量約30 g)均由中國科學院上海實驗動物中心提供。飼養房間溫度(22±2)℃，12 h照明/12 h黑暗循環，飲水，給予標準嚙齒類動物飲食供應。動物實驗遵循“北京醫科大學動物照料及福利委員會”準則。

1.2 材料 分析純葡萄糖(上海國藥集團化學試劑公司)，葡萄糖測定試劑盒(北京鼎國生物技術有限公司)，人胰島素及exendin-4(美國Lilly公司)。EW樣品為本實驗室通過大腸桿菌表達合成，見文獻[18-19]。

1.3 方法

1.3.1 血漿葡萄糖測定方法 C57BL/6小鼠和db/db小鼠禁食18 h后，用毛細管取10 μL尾靜脈血，轉入肝素化微量離心管中，離心后將血漿保存于-20 ℃。采用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖。

1.3.2 各藥物在C57BL/6小鼠中的降糖作用 按照隨機數字表，將C57BL/6小鼠隨機分為3組(n=10)，取空腹血后每組小鼠分別腹腔注射EW(2 μg EW，100 μL的0.9%氯化鈉液)、exendin-4(2 μg exendin-4，100μL的0.9%氯化鈉液)、100 μL的0.9%氯化鈉液；3組均于即刻及每隔2 h腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，共5次。每次腹腔注射葡萄糖后20 min取尾靜脈血，測定血糖。

1.3.3 各藥物在db/db小鼠中的降糖作用 按照隨機數字表，將db/db小鼠隨機分為3組(n=3)，取空腹血后每組小鼠分別腹腔注射低濃度EW溶液(2 μg EW，100 μL的0.9%氯化鈉液)、高濃度EW溶液(5 μg EW，100 μL的0.9%氯化鈉液)、100 μL的0.9%氯化鈉液；3組均于即刻及每隔4 h腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，共3次。每次腹腔注射葡萄糖前及腹腔注射葡萄糖后30 min取尾靜脈血，測定血糖。

1.3.4 C57BL/6小鼠中EW對胰島素的增敏作用 C57BL/6小鼠禁食18 h后，按照隨機數字表將其隨機分成6組(n=3)。其中3組毛細管取10 μL尾靜脈血，測得血糖為基礎血糖(base)，取血后每組小鼠分別腹腔注射胰島素0.3、1.0、2.0 μg，隨后即刻腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，腹腔注射葡萄糖后20 min取10 μL尾靜脈血，測定血糖；另外3組C57 BL/6小鼠取空腹血后每組小鼠(n=3)分別腹腔注射胰島素0.3 μg、EW 0.2 μg、胰島素0.3 μg+EW 0.2 μg后，即刻腹腔注射20%葡萄糖300 μL(60 μg)，腹腔注射葡萄糖后20 min取10 μL尾靜脈血，測定血糖。

1.3.5 EW的急性毒性實驗 按照隨機數字表將昆明鼠隨機分為3組(n=10)，每組分別一次腹腔注射EW 0.1 mg/100 μL的0.9%氯化鈉液、EW 0.2 mg/100 μL的0.9%氯化鈉液及100 μL的0.9%氯化鈉液，觀察小鼠1周內存活數量。

2 結 果

2.1 各藥物在C57BL/6小鼠中的降糖作用 腹腔注射葡萄糖前EW組、exendin-4組及0.9%氯化鈉液組平均血糖分別是(6.39±1.37)mmol/L、(5.87±1.16)mmol/L及(6.18±1.15)mmol/L (P>0.05)。4次葡萄糖注射后，0.9%氯化鈉液組平均血糖逐漸上升至(25.04±2.10)mmol/L ，而EW組及exendin 4組平均血糖分別是(8.54±2.10)mmol/L 及(6.93±1.84)mmol/L，后2組間差異無統計學意義，但2組與0.9%氯化鈉液組比較差異有統計學意義(P<0.01)。0、2、4、6 h腹腔注射葡萄糖后，EW組及exendin-4組血糖均維持在正常范圍內，8 h腹腔注射葡萄糖后EW組及exendin-4組血糖明顯上升，2組間差異無統計學意義，但與0.9%氯化鈉液組差異仍有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 各藥物在db/db小鼠中的降糖作用 腹腔注射葡萄糖前EW 2 μg組、EW 5 μg組及0.9%氯化鈉液組平均血糖分別是(21.33±5.10)mmol/L、(20.46±3.15)mmol/L 和(19.37±2.92)mmol/L (P>0.05)。第1次腹腔注射葡萄糖30 min后，0.9%氯化鈉液組血糖顯著上升至(26.9±4.75)mmol/L，而EW 2 μg組及EW 5 μg組平均血糖分別為(18.16±1.90)mmol/L及(12.87±2.63)mmol/L，與0.9%氯化鈉液組比較差異有統計學意義(P<0.01)，且EW 2 μg組及EW 5 μg組間差異有統計學意義(P<0.01)，EW治療劑量增大，降糖效果明顯。第1次腹腔注射葡萄糖1 h后，0.9%氯化鈉液組平均血糖為(22.23±3.52)mmol/L，而EW 2 μg組及EW 5 μg組平均血糖分別為(15.00±2.72)mmol/L 及(10.87±1.59)mmol/L，與0.9%氯化鈉液組比較差異有統計學意義(P<0.01)，且EW 2 μg組及EW 5 μg組差異仍有統計學意義(P<0.01)，EW 5 μg組降糖效果較好。第一次腹腔注射葡萄糖4 h后EW 2 μg組、EW 5 μg組與0.9%氯化鈉液組平均血糖差異均有統計學意義(P<0.01)，EW 2 μg組及EW 5 μg組間差異亦有統計學意義(P<0.01)。第2次腹腔注射葡萄糖30 min后測定平均血糖，EW組與0.9%氯化鈉液組差異有統計學意義(P<0.01)，且EW 2 μg組及EW 5 μg組間差異仍有統計學意義(P<0.01)。第5次腹腔注射葡萄糖8 h后EW 2 μg組、EW 5 μg組與0.9%氯化鈉液組平均血糖差異無統計學意義(P>0.05)。第3次腹腔注射葡萄糖30 min后測定平均血糖，EW組與0.9%氯化鈉液組差異有統計學意義(P<0.01)，且EW 2 μg組及EW 5 組差異仍有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖1 腹腔注射5次60 μg葡萄糖后C57BL/6小鼠的血糖水平

圖2 腹腔注射3次60 μg葡萄糖后db/db小鼠的血糖水平

2.3 C57BL/6小鼠中EW對胰島素的增敏作用 胰島素的降低血糖作用呈劑量依賴性，當胰島素劑量為0.3 μg時，無明顯降糖效果，而當胰島素劑量為2 μg時，降糖效果明顯。見圖3右圖。當注射胰島素0.3 μg及EW 0.2 μg時發現血糖無明顯下降，而當注射胰島素0.3 μg+EW 0.2 μg時血糖下降明顯，說明EW對胰島素有增敏作用。見圖3左圖。

圖3 EW對胰島素的增敏作用

2.4 安全性 昆明鼠腹腔注射0.1 mg EW/100 μL的0.9%氯化鈉液、0.2 mg EW/100 μL的0.9%氯化鈉液及0.9%氯化鈉液后觀察1周，所有小鼠均存活，證明應用EW安全。

3 討 論

exendin-4可與GLP-1受體結合而激活受體，它的N-端序列(His、Gly、Glu)不被DPP4所識別(DPP4通常迅速切斷GLP-1的N-端的His、Ala、Glu序列)，exendin-4在體內半衰期比GLP-1長。將exendin-4縮短至32個氨基酸，并更換一些氨基酸，設計得到exendin-4類似物EW，將EW串聯后在E.coli中表達，通過胰蛋白酶定點切斷獲得重組EW，EW分子量為3581.5 Da。

C57BL/6小鼠是具有2型糖尿病傾向的小鼠模型，其基線血糖基本正常，給糖后其血糖水平明顯高于正常鼠模型昆明鼠。本研究顯示，EW在C57BL/6小鼠體內有良好的降糖活性，僅1次給予EW或exendin-4后，每隔2 h給予糖負荷，降糖作用可保持6 h以上，而且2 μg的EW與2 μg的exendin-4降糖效果無顯著差異。這表明EW的降糖作用及有效作用時間與exendin-4相當，故exendin-4 C-端的7個氨基酸對于exendin-4在體內的生物活性并非必須。32個氨基酸的EW，從長度和結構而言，更接近人源的GLP-1；從理論上而言，可以減少過敏反應的產生，增加安全性。1次給予2 μg的EW，無明顯低血糖反應，證明EW的降糖機制是血糖依賴的，故避免了低血糖，增加了安全性。1次給予2 μg的EW后，反復給予60 μg葡萄糖，血糖保持穩定8 h，說明EW是一個中效的抗糖尿病藥物。

db/db小鼠是2型糖尿病鼠模型，空腹血糖即有增高，給糖后血糖進一步增高。本研究顯示，EW在db/db小鼠中有血糖依賴的降糖作用，無明顯低血糖反應，增加EW劑量可以使降糖效果更為顯著。

本研究在C57BL/6小鼠中，進一步將小劑量的EW與小劑量的胰島素合用，結果發現，EW對胰島素有增敏作用。目前對exendin-4增加胰島素敏感性的研究并不多，有待進一步研究。

昆明鼠是正常小鼠模型，本研究對昆明鼠腹腔注射超大劑量的EW，所有小鼠均存活，驗證了EW的安全性。

綜上所述，EW具有良好的生物體內降糖活性及安全性，是一種很有前景的抗糖尿病藥物，它能通過基因工程大規模廉價的生產獲得，值得進一步研究。

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