胃癌中CDK6 mRNA表達變化研究

潘新民，徐國輝，秦豪杰，高林波，張 林

·基礎醫學·

胃癌中CDK6mRNA表達變化研究

潘新民1，徐國輝1，秦豪杰1，高林波2，張 林3

目的探討胃癌中CDK6 mRNA含量的變化。方法采用實時熒光定量PCR檢測胃癌及癌旁組織中CDK6 mRNA的表達。結果胃癌組織中CDK6 mRNA 含量為0.433±0.468，癌旁組織為1.304±1.206，兩組相比，差異具有統計學差異(P<0.05)。結論CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織表達水平明顯高于癌組織。

胃癌；CDK6；實時熒光定量PCR

CDKs是細胞周期調控網絡的中心，失活或異常表達時可導致細胞癌性轉化[1]。CDK6是調控細胞G1-S期關鍵因素之一[2]，人類許多腫瘤的發生與CDK4或CDK6(Cyclin dependent kinase 6,CDK6)相關[3-6]。研究發現CDK6蛋白在肝癌[7]、淋巴癌[8]、宮頸癌[9]、皮膚瘢痕癌[10]等表達呈弱陽性至表達增強，而在88%的腸癌組織[11]、69%的胃癌組織中[12]等呈陽性表達，但未見有相關CDK6 mRNA定量的報道。通過實時熒光定量PCR技術通過反轉錄RNA，經聚合酶鏈式反應實時監測cDNA的放大[13]。因為擴增指數增長期測量值與特異cDNA(RNA)起始量存在相關性，在擴增的指數增長期測量擴增產物實現定量檢測[14]。本研究運用實時熒光定量PCR檢測CDK6 mRNA在胃癌組織中的表達，為探索CDK6在胃癌發病中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 PrimerScriptTMRT reagent Kit(Takara Co.,Japan)，SYBR?PremixExTaqTMⅡ Kit(TaKaRa Co.,Japan)，RNAiso Reagent(Takara Co.,Japan)DEPC (GIBCO Co.,USA)，異丙醇、氯仿、無水乙醇等其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 實驗儀器 ABI 7500熒光 RT-PCR儀(ABI Co.,USA)，低溫高速離心機(Eppendorf Co.,Germany)，微量移液器(Eppendorf Co.,Germany)，XH-89旋渦振蕩器(浙江樂清儀器廠)，NANODROP 1000超微量紫外分光光度計(Thermo Scintific,USA)，-80℃冰箱 (SANYO Co.,Japan)，BS210S型電子天平(Sartorius Co.,USA)，純水體系(MilliPure Co.,France)，超聲勻漿器(寧波新芝公司)。

1.1.3 組織標本 采集胃癌癌組織及癌旁組織13例，男性6例，女性7例，平均年齡(61.8±11.4)歲。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織標本總RNA提取 操作簡介：取經DEPC處理干燥的EP管置于冰上，每管加入500 μL RNAisoTM Plus，分別取20 mg胃癌癌組織及癌旁組織，超聲勻漿后靜置5 min。12 000 g 4℃離心5 min。移液器吸出上清加入氯仿(RNAisoTM Plus的20%體積量)，振蕩充分乳化后離心5 min，吸取上清液轉移加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min。離心10 min后棄上清，緩慢加入75%乙醇1 mL。離心5 min，室溫下干燥沉淀5 min，加入30 μL DEPC雙蒸水，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存。抽取1 μL采用NANODROP 1000超微量紫外分光光度計進行RNA定量檢測。

1.2.2 RNA的反轉錄反應 按PrimerScriptTMRT reagent Kit組份配制反轉錄反應液(在冰盤上操作)：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL，充分混勻，按照37℃ 15 min，85℃ 5 s進行反轉錄，反應產物-20℃保存備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測CDK6 mRNA胃癌中的表達 ①引物的設計與合成：根據GeneBank數據庫中CDK6基因mRNA的序列(AK313491)設計CDK6的引物如下：

上游引物: 5’-TCAGGTTGTTTGATGTGTGC-3’

下游引物: 5’-TCCTTTATGGTTTCAGTGGG-3’

根據GeneBank數據庫中GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因mRNA的序列(AF261085)設計GAPDH的引物如下：

上游引物: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

下游引物: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

②實時熒光定量PCR擴增標準曲線的制備：以單鏈cDNA作為模板進行常規PCR反應，分別擴增CDK6和GAPDH， PCR反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定條帶位置與大小正確后，參照BioTake PCR產物回收試劑盒中的操作說明，回收、純化PCR產物，經測序證實其序列與GeneBank中CDK6及GAPDH序列一致。將所得樣品用easy dilution RNase水1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀釋，制作成為標準品用于real time PCR標準曲線的制備。③待測組織中CDK6 mRNA 檢測和定量分析：采用雙標準曲線法，按照Takara Co.SYBR?PremixExTaqTMⅡ說明書進行操作。使用20 μL反應體系進行real time PCR檢測胃癌及癌旁組織CDK6 mRNA含量。充分混勻后，在ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀上，設置反應條件：95℃10 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40個循環；反應結束后增加融解。曲線分析：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；每個樣本復孔3個，得到標準曲線、融解曲線和樣本的相對定量。每個樣本的內參基因GAPDH在相同條件下擴增，附加陰性對照作為質量控制。統一基線基準，在與基線交點的循環次數(Ct) 值為縱坐標，各標準管濃度的對數值為橫坐標，制作標準曲線，選擇PCR基線進行數據分析和修正，根據待測樣本的Ct 值求出相應基因的相對表達量。以標本CDK6相對表達量/對應GAPDH相對表達量，得到校正后每個樣本CDK6 mRNA的表達水平。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR引物特異性驗證在260 nm和280 nm超微量紫外分光光度計測定吸光值，提取的純RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.1之間。融解曲線分析實時熒光定量PCR擴增產物及引物二聚體，驗證PCR產物的特異性。本組數據顯示融解曲線單一峰型，說明CDK6與GAPDH熒光定量PCR擴增引物特異性好，未見引物二聚體等非特異性擴增。

2.2 實時熒光定量PCR擴增效率檢測取1份樣品，分別做1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀釋，然后分別作目的基因CDK6和內參基因GAPDH標準曲線。擴增完成后，可直接測出CDK6和GAPDH對應的R2，分別為0.994和0.996，斜率分別為-3.336和-3.359。根據公式E=10-1/K-1(E為擴增效率，K為標準曲線的斜率)計算得到擴增效率分別為：99.42%(CDK6)和98.48%(GAPDH)，符合相對定量法的使用斜率。

2.3 CDK6在結直腸癌和胃癌組織中的表達CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織表達水平為1.304±1.206，明顯高于癌組織0.433±0.468(t=-2.669，P=0.02)。

3 討論

在不同腫瘤或腫瘤的不同類型中CDK6的表達可能并不相同，在子宮內膜腺癌[9，16]、鼻咽癌[17]CDK6表達增高，并且與腫瘤分化程度和臨床分期等有關，但在不同的淋巴瘤中，CDK6的表達并不相同[8，15]。在88%的腸癌組織[11]、69%的胃癌組織中[12]等呈陽性表達。有研究使用CDK6 mRNA探針顯示有少部分肝癌細胞CDK6 mRNA呈弱陽性表達[7]，可能與抑制因子的缺失或mRNA降解有關，使CDK6 蛋白的表達異常，出現細胞增殖、腫瘤的發生、轉移和浸潤等。通過實時熒光定量PCR發現CDK4 mRNA在鼻咽癌[18]和乳腺癌[19]中的表達上調，并且與部分臨床特征呈正向相關趨勢。然而，尚未見CDK6 mRNA在胃癌中的表達研究。

熒光染料能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要設計探針，檢測成本相對較低。但因為它能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結合而產生假陽性信號。對于引物二聚體非特異性結合常使用融解曲線分析擴增的特異性。實驗顯示融解曲線僅呈現單一平滑峰型時，標準品與樣品重合良好，表明擴增特異性良好[20]。PCR閾值是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值設置一般是3～15個循環的熒光信號標準偏差的10倍。利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，以未知樣品的Ct值從標準曲線上得出該樣品的起始拷貝數[21]。本研究采用GAPDH作為內參[22]，CDK6與GAPDH融解曲線呈單一平滑峰型，擴增效率均衡一致，復孔均一性好，閾值在正常范圍內。

本研究檢測到CDK6 mRNA在胃癌癌旁組織中表達明顯高于癌組織，考慮到本研究抽樣及樣本含量，擴大樣本量或運用其他實驗方法驗證將有助于了解其發生發展的詳細機制。

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TheExpressionofCDK6mRNAinGastricCancer

PAN Xin-min,XU Guo-hui,QIN Hao-jie,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo explore the expression ofCDK6 mRNA in gastric cancer.MethodsThe expression ofCDK6 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR with GAPDH as an internal reference.ResultsThe expression ofCDK6 mRNA was 0.433±0.468 in gastric cancer tissues and 1.304±1.206 in normal adjacent tissues respectively.It was statistically significant between gastric cancer tissues and normal adjacent tissues (P<0.05).ConclusionThe expression ofCDK6 mRNA is higher in normal adjacent tissues of gastric cancer than that in cancer tissues.

gastric cancer;cyclin dependent kinases 6;real-time fluorescence quantitative PCR

國家自然科學基金項目(81302149)， 河南省科技廳自然科學基金項目(132300410105)

2014-01-10

1.河南科技大學法醫學院，河南洛陽 471003 2.四川大學華西第二醫院，四川成都 610041 3.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川成都 610041

潘新民(1969-)，男，河南洛陽人，副教授，從事法醫病理、分子病理學工作。

張林，男，教授，博士生導師，E-mail：zhanglin@scu.edu.cn

Q754，R735.2

A

1672-688X(2014)02-0081-03