腺病毒介導的ING4基因對人肺腺癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用及其分子機制

黃錦宏 楊吉成 凌春華 趙大國 謝宇鋒 由振華

生長抑制因子4 （inhibitor of growth 4, ING4）基因屬生長抑制因子（ING）家族成員，最初在人腦垂體中被分離出來[1]。該基因定位于染色體12p13-31區域內，由8個外顯子和7個內含子組成，cDNA全長1,380 bp，編碼蛋白含249個氨基酸分子[2]。生物信息學分析顯示ING4有一個PHD（plant homeodomain）鋅指區和核定位信號（NLS）區。ING4基因在多種腫瘤中易發生缺失突變和/或表達下調，并與腫瘤發生和腫瘤惡性程度密切相關[3,4]。外源性ING4基因可通過多種途徑發揮抗腫瘤效應，對多種腫瘤細胞具有抑癌作用，其抑癌作用與抑制腫瘤細胞生長和腫瘤血管的生成，誘導腫瘤細胞凋亡，調節腫瘤細胞生長周期、引起G2/M期阻滯，增強p53活性等有關[5-8]；為研究ING4在肺癌基因治療中的應用，本研究建立SPC-A1細胞肺腺癌裸鼠移植瘤模型，通過腺病毒介導的ING4（Ad-ING4）基因治療，觀察ING4對移植瘤的生長抑制作用，并對其可能的分子機制進行了研究，為肺癌的基因治療提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人肺腺癌細胞株SPC-A1細胞、攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的腺病毒（adenovirus Ad-GFP）和腺病毒介導的ING4（Ad-ING4）均由蘇州大學基礎醫學系細胞與分子生物學教研室提供；培養基RPMI-1640，胎牛血清購自Gibcol Brl公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術研究所；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、環氧化酶-2（COX-2）、Fas、FasL一抗、二抗均購自福州邁新生物技術公司（進口分裝）。

1.1.2 實驗動物 3周-4周齡，體重約20 g，雄性BALB/cnu/nu裸鼠15只，購自中科院上海斯萊克實驗動物中心［許可證號：SCXK(滬)2007-0005］，飼養于蘇州大學實驗動物中心SPF級動物室，自由攝入經過嚴格滅菌處理的飼料及水，實驗操作遵守無菌原則。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養 SPC-A1細胞用RPMI-1640完全培養基（10%FCS），在37oC、5%CO2的培養箱內培養，2天-3天傳代一次，取對數生長期的細胞進行造模。

1.2.2 肺腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 取對數生長期的SPC-A1肺腺癌細胞，用PBS調整細胞濃度制備3.0×107/mL的細胞懸液，于裸鼠右前腋皮下接種細胞懸液100 μL，隔日觀察并記錄肺癌細胞在裸鼠體內的生長和成瘤情況。

1.2.3 Ad-ING4對裸鼠移植瘤生長的影響 按常規法[9]進行，即接種2周左右且腫瘤體積約為0.15 cm3時，應用抽簽法將15只裸鼠隨機均分為3組，即：①PBS組：給50 μL PBS/只；②Ad-GFP組：給Ad-GFP 50 μL（1.5×109pfu/mL）/只；③Ad-ING4組：給Ad-ING4 50 μL（1.5×109pfu/mL）/只；各組均采用瘤體內注射干預用藥，隔日1次，共注射6次。第1次治療前及開始治療后隔日測量各組瘤體的瘤長徑（L）和短徑（S），根據公式V（cm3）=L ×S2×0.5（V：瘤體積，L：長徑，S：短徑），繪制瘤體體積-時間變化曲線；治療15 d后，將裸鼠脫頸處死，取瘤體組織稱重，計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.2.4 腫瘤組織病理學檢查及凋亡指數測定 將腫瘤組織用10%中性甲醛固定過夜，常規石蠟包埋，切片，常規HE染色，用以觀察各組腫瘤組織細胞的形態變化，初步判斷SPC-A1肺腺癌細胞的凋亡情況。用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態學特征判定為凋亡細胞。每張切片在高倍視野下（×400）取5個視野，分別計數凋亡細胞數和細胞總數，計算凋亡指數：凋亡指數（apoptotic index, AI）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.5 免疫組織化學SP法檢測凋亡相關因子的表達 取上述各組瘤體組織，用免疫組織化學SP法染色，檢測Caspase-3、COX-2、Fas與FasL凋亡相關因子的表達。以高倍鏡（×400）下10個視野的陽性細胞數，取平均值（陽性細胞為細胞質內呈彌漫狀分布的棕黃色顆粒）作為各凋亡相關因子的表達強度。

1.3 統計學處理 用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理。實驗數據用Mean±SD表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖 1 肺腺癌裸鼠移植瘤生長抑制比較（與PBS組、Ad-GFP組比較，*P＜0.05）。 A：動物實驗大體圖，可見種植后有瘤體生長；B：瘤體重量比較；C：各組瘤體體積-時間變化曲線。Fig 1 Inhibition of human lung adenocarcinoma xenografts by Ad-ING4 (*P＜0.05 compared with PBS and Ad-GFP group). A： The pictures of human lung adenocarcinoma xenografts； B： The weight change of human lung adenocarcinoma xenografts treated with Ad-ING4； C： The curves of tumor volume of human lung adenocarcinoma xenografts after treatment.

2 結果

2.1 Ad-ING4對裸鼠移植瘤生長的影響 本實驗中成功地建立了SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率為100%。治療15 d后，Ad-ING4組的腫瘤體積及重量明顯小于PBS組和Ad-GFP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ad -ING4組的抑瘤率（33.17%±5.24%）與Ad-GFP組（1.31%±0.31%）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 瘤體組織病理學檢查 各組瘤體組織進行HE染色，高倍鏡下觀察各組腫瘤組織細胞凋亡情況，腫瘤細胞凋亡的判斷標準：細胞體積變小，細胞質濃縮，細胞核固縮、碎裂、溶解，組織間有大量空泡形成。結果顯示：PBS組和Ad-GFP組瘤體組織的腫瘤細胞排列密集，癌細胞異型性明顯，未出現上述細胞凋亡特征；Ad-ING4組中大量細胞呈細胞核固縮、裂解或溶解，細胞質濃縮，細胞膜不完整，組織間有大量空泡形成，呈現明顯的細胞凋亡形態特征（圖2）。

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 結果顯示，細胞核中有棕黃色著染者為陽性細胞，染色質凝聚、濃縮，呈凋亡細胞的形態學征象，部分陽性細胞核染色質仍很疏松，部分呈圓形深染的棕黃色小體，為典型的凋亡小體。各組凋亡的細胞數目存在差別，Ad-ING4組的凋亡指數（69.23%±6.53%），與PBS組（17.04%±1.10%）、Ad-GFP組（18.81%±1.93%）比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 瘤體組織中凋亡相關因子的表達 免疫組織化學SP法染色結果顯示，Ad-ING4組的Caspase-3、Fas與FasL陽性細胞數均明顯高于PBS組和Ad-GFP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ad-ING4組的COX-2陽性細胞數低于PBS組和Ad-GFP組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖3）。

表 1 各組腫瘤組織中相關因子表達的比較Tab 1 Expression change of cytokines in human lung adenocarcinoma xenografts

3 討論

基因治療是將人類的正常基因或有治療作用的外源目的基因，通過一定的基因轉運系統導入人體靶細胞或直接注入人體，表達具有功能的蛋白質，以達到補充、糾正基因的缺陷，從而達到治療疾病的目的[10]。而肺癌是目前世界上發病率最高的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要病因之一[11]。因此，針對肺癌的基因治療成為當今研究的熱點之一。

本研究采用SPC-A1細胞株建立了肺腺癌裸鼠移植瘤模型，并進行ING4基因治療，治療結果顯示與對照組（PBS組、Ad-GFP組）比較，Ad-ING4組的腫瘤體積、瘤重明顯減小，抑瘤率明顯增加，TUNEL檢測顯示Ad-ING4組移植瘤的凋亡指數也增加，說明ING4基因對肺癌可能通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤生長。

細胞凋亡包括兩條主要途徑，即外源性途徑和內源性途徑，而細胞凋亡最終都需通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）級聯反應來實現，其中Caspase-3處于核心位置，是凋亡級聯反應中的關鍵蛋白酶[12,13]。張等[6]研究認為ING4能誘導T24膀胱癌細胞中的Bax基因轉錄明顯上調，Bcl-2基因的轉錄水平明顯下降，使Bcl-2/Bax的比值下降，最終促使Caspase-3被激活，從而發揮促凋亡作用。Fas是一種重要的死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族（tumor necrosisfactor receptor, TNFR），是細胞凋亡的主要受體分子。FasL為Fas的天然配體，當Fas與FasL結合后可依次激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7誘導細胞凋亡[14]；本研究通過免疫組化顯示，Ad-ING4能使肺癌移植瘤細胞中Fas/FasL、Caspase-3陽性細胞數均明顯增加，表明Fas/FasL凋亡因子上調，可使Caspase-3被進一步激活，從而加速細胞凋亡。

COX-2是前列腺腺素生成過程中的限速酶，COX-2在包括肺癌在內的多種腫瘤組織中均呈高表達，它可通過合成致癌物質，從而抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤血管新生，促進腫瘤侵襲和轉移[15,16]。本研究顯示，Ad-ING4組中COX-2陽性細胞數明顯下降，表明抑制COX-2的高表達，從而調節Caspase-3基因表達水平，可能是ING4基因促進肺癌細胞凋亡作用的另一分子機制。

圖 3 免疫組化染色顯示Caspase-3、COX-2、Fas和FasL的表達 （SP，× 400）Fig 3 Expression change of Caspase-3, COX-2, Fas and FasL（SP, × 400 ）

綜上所述，本研究初步顯示，腺病毒介導的ING4基因對SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤具有生長抑制作用，其機制可能與明顯上調Caspase-3、Fas/FasL，下調COX-2的表達相關；然而ING4的抑癌作用是否還存在其他的分子機制尚有待進一步研究，從而為ING4基因治療肺癌提供更充分的實驗依據。