Rap2a真核表達質粒的鑒定及其對肺癌細胞遷移能力的影響

吳金霞 桑苗苗 曹文嘉 鄭駿年 裴冬生

Ras超家族在信號轉導過程中發揮著分子開關的作用,可作用于下游的多種受體蛋白,介導細胞外信號引起的胞質或胞核生物學特性的改變,調控細胞的多種生命活動進程[1,2].Rap蛋白(Rap1a, Rap1b, Rap2a, Rap2b,Rap2c)屬Ras相關小GTP酶蛋白超家族.Rap1與Ras擁有相同的效應因子結構域,提示Rap1可與Ras競爭其下游效應因子,從而發揮拮抗Ras的功能.Rap2有其獨特的生物學特性,其亞細胞定位主要集中在胞膜及內膜系統,在細胞靜息狀態下的活化水平超過50%,并且其效應因子結構域的第39位氨基酸殘基為苯丙氨酸.因此,Rap2與Rap1和Ras在效應因子結構域的微小差異使得Rap2可能擁有特異的效應因子從而產生特定的生物學效應.

Rap2a最先于1988年由Pizon等[3]在對BurKitt's淋巴瘤cDNA文庫進行篩選時被發現,主要定位于細胞膜和內膜系統.Rap2a基因全長549 bp,編碼183個氨基酸,定位于13q34,其結構域組成與Ras家族蛋白相似,主要包括第32-40位氨基酸位置上的效應因子結構域,第11-148位氨基酸殘基的5個散在分布的核苷酸結合域和C末端的CAAX基序.其C端CAAX基序與膜定位功能有關,此基序突變后可引起Rap2a許多功能喪失[4,5].值得一提的是,Rap在調節整聯蛋白的功能和細胞粘附,進而控制細胞運動和細胞與基質的相互聯系方面起著重要的作用[6,7].除了細胞這些生物學方面的基礎性研究外,近些年來人們把目光又集中到Rap的一些特殊功能以及腫瘤方面的研究.腫瘤細胞的遷移和粘附在腫瘤侵襲轉移中起著重要作用,有報道[8,9]顯示Rap2蛋白可影響人類多種腫瘤的遷移和粘附從而影響腫瘤的侵襲和轉移.但其對肺癌的發生發展有何意義,目前尚未見報道.

1 材料和方法

1.1 材料 骨肉瘤細胞株U2OS,肺癌細胞株H1299和A549,人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),DH5α感受態細胞及pcDNA3.1(+)為本實驗室保存.限制性內切酶HindIII和EcoRI,RT-PCR試劑盒及T4 DNA連接酶購自Takara公司;PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司;質粒DNA回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自Promega公司;RNA抽提試劑盒、質粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司;質粒轉染試劑LipofectamineTM2000為美國Invitrogen公司產品.兔抗人Rap2a抗體購自Abcam公司,抗人β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司.熒光羊抗鼠和熒光羊抗兔IgG購自美國Licor公司,經Odyssey掃描儀掃描處理.

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測Rap2a在肺癌細胞中的表達 使用冰浴的細胞裂解buffer從各組細胞中提取細胞總蛋白.蛋白樣品用12.5% SDS-PAGE跑膠后轉膜至NC膜上.脫脂牛奶室溫封閉1 h后用抗Rap2a抗體過夜.充分洗膜后室溫孵育二抗1 h,再次洗膜后顯影.

1.2.2 cDNA的獲取 人骨肉瘤細胞株U2OS棄去細胞表面培養基,胰酶消化細胞并用PBS沖洗后,按照Qiagen公司RNA抽提試劑盒說明書進行.抽提的RNA根據所測得的濃度取出相應含量的RNA用于反轉錄,獲得cDNA文庫.1.2.3 基因克隆 參照Genebank refseq中收錄的NM_021033.6序列,設計針對Rap2a基因全長開放閱讀框(open reading frame, ORF)區引物,上游5'GAAGCTTAT GCGCGAGTACAAAG3',下游5'GGAAttCCTAttGTATGttACATG3',以已獲得的cDNA文庫為模版,PCR擴增得到特異性產物.

1.2.4 pcDNA3.1(+)-Rap2a質粒的構建 擴增的Rap2a基因,經EcoRI和HindIII雙酶切后,用T4 DNA連接酶連接到同樣用EcoRI和HindIII雙酶切的pcDNA3.1(+)中,構建pcDNA3.1(+)-Rap2a真核表達質粒.經酶切初步鑒定后送上海華大基因科技有限公司測序驗證.

1.2.5 細胞轉染 待細胞處于約80%-90%融合時進行轉染.按小皿的標準計算,每孔加入2 μg質粒,用LipofectamineTM2000轉染試劑進行轉染.

1.2.6 Transwell小室遷移實驗 H1299和A549細胞轉染Rap2a 24 h后,用胰酶消化收集細胞,用無血清培養基制成濃度為3 X104/mL的細胞懸液150 μL,加入Transwell小室的上室,下室加入600 μL含有10% FBS的條件培養基,繼續在孵育箱中培養12 h.12 h后,室溫固定,結晶紫染色,用濕棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞后顯微鏡下隨機取5個視野拍照,計數并統計結果.

1.2.7 明膠酶譜實驗 細胞轉染同前,轉染后48 h換成1 mL無血清培養基繼續培養24 h.次日收集上清液,將上清液移入離心管,2,000 rpm離心10 min,BCA法測定各樣品蛋白濃度,根據不同濃度確定樣品的上樣體積,保證各樣品上樣的蛋白質量相同,與4X上樣緩沖液混合,跑膠,分別置于孵育液、洗脫液、脫色液中處理,顯出基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2位于藍色背景上的透亮帶,用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶面積,寬度和灰度值,做統計分析.

1.3 統計學方法 使用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析,實驗數據以均數±標準差表示,兩組間均數比較采用t檢驗分析.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 Rap2a蛋白在肺癌細胞中的表達水平 以HUVEC作為對照,采用Western blot技術檢測Rap2a蛋白在H1299和A549兩種肺癌細胞中的內源性表達量.結果顯示相對于正常細胞組,肺癌細胞中Rap2a表達明顯增高(圖1).

圖 1 Rap2a蛋白在肺癌細胞H1299和A549中的表達.A:Western blot檢測Rap2a蛋白在各組中的表達;B:Rap2a蛋白灰度分析.與HUVEC組比較:**P<0.01(n=3).Fig 1 Rap2a protein expression in H1299 and A549 cell lines. A: Western blot was used to analyze the expression of Rap2a protein; B: Densitometric analysis of Rap2a. The intensity of Rap2a was quantified by densitometry (software: Image J, NIH). Compared with HUVEC group: **P<0.01 (n=3).

2.2 Rap2a真核表達質粒構建 以骨肉瘤細胞株U2OS抽提并反轉錄的cDNA為模板,用設計的Rap2a引物PCR,結果顯示經瓊脂糖凝膠電泳的PCR產物在500 bp-600 bp之間,與Rap2a基因的549 bp位置大概一致(圖2).成功將Rap2a基因的全長ORF區克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體,用EcoRI和HindIII雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳驗證并送專業公司測序,核酸測序結果與Genebank序列完全一致(圖3).

圖 2 PCR鑒定Rap2a電泳圖.M:1,500 bp DNA Marker;S:Rap2a.Fig 2 Rap2a of PCR amplification products. M: 1,500 bp DNA Marker; S: Rap2a.

2.3 pcDNA3.1(+)-Rap2a在真核細胞中表達的鑒定 為進一步檢測Rap2a蛋白是否表達成功,我們用pcDNA3.1(+)-Rap2a轉染H1299和A549細胞,提取總蛋白,用抗Rap2a抗體檢測Rap2a在H1299及A549細胞的表達,以轉染pcDNA3.1(+)空質粒組作為對照.結果顯示相對于空白載體組,過表達組Rap2a表達明顯增加(圖4).

2.4 Rap2a對腫瘤細胞遷移能力的影響 我們對兩種肺癌細胞進行了Transwell細胞遷移實驗.用pcDNA3.1(+)-Rap2a轉染H1299和A549細胞,以轉染pcDNA3.1(+)空質粒組作為對照.結果顯示實驗組細胞的遷移率明顯高于空白載體組,說明Rap2a過表達可促進肺癌細胞H1299和A549的遷移(圖5).

圖 3 pcDNA3.1(+)-Rap2a克隆構建.A:由左至右依次為M1:1,500 bp DNA Marker;1:pcDNA3.1(+);2:pcDNA3.1(+)-Rap2a;3:pcDNA3.1(+)-Rap2a;M2:10,000 bp DNA Marker;B:Rap2a測序結果峰圖.Fig 3 Vector construct of pcDNA3.1(+)-Rap2a. A is electrophoretogram of pcDNA3.1(+)-Rap2a, from left to right: DNA Marker, pcDNA3.1,pcDNA3.1(+)-Rap2a, pcDNA3.1(+)-Rap2a, DNA Marker; B is sequencing result of Rap2a.

圖 4 轉染Rap2a質粒后Western blot檢測Rap2a蛋白的表達.A:Western blot檢測Rap2a過表達效果;B:Rap2a蛋白灰度分析.與vector組比較:**P<0.01(n=3).Fig 4 Western blot analyses of Rap2a after transfection with the Rap2a expressing vector. A: Western blot was used to analyze the expression of Rap2a protein after transfection with Rap2a; B: Densitometric analysis of Rap2a. The intensity of Rap2a was quantified by densitometry (software:Image J, NIH). Compared with vector group: **P<0.01 (n=3).

2.5 Rap2a過表達后對細胞分泌基質金屬蛋白酶MMP2的影響 明膠酶譜實驗檢測了H1299和A549兩種肺癌細胞分泌MMP2活性的表達.結果顯示,Rap2a過表達后兩種肺癌細胞分泌MMP2的量明顯增加.灰度分析其MMP2表達量也明顯增加,差異有統計學意義(P<0.01).說明上調Rap2a的同時也能上調MMP2的表達(圖6).

3 討論

圖 5 Rap2a過表達后對肺癌細胞H1299和A549遷移能力的影響(X100).A:Transwell檢測細胞遷移能力.B:細胞穿膜細胞數統計圖.與vector組比較:**P<0.01 (n=3).Fig 5 The impact of Rap2a overexpression on lung cancer cell migration (X100). A: Transwell were applied to test the impact of Rap2a expression on the cell migration of H1299 and A549 after transfection; B: Statistical figure of the numbers of cell permeating septum. Compared with vector group: **P<0.01 (n=3).

圖 6 Rap2a過表達后明膠酶譜檢測細胞分泌MMP2的情況.A:明膠酶譜檢測細胞分泌MMP2情況;B:MMP2灰度分析.與vector組比較:**P<0.01 (n=3).Fig 6 Gelatin zymography analysis of the relative enzyme activities of cleaved-MMP2 after overexpression of Rap2a. A:Gelatin zymography was used to analyze the expression of MMP2 after transfection with Rap2a; B: Densitometric analysis of MMP2. The intensity of MMP2 was quantified by densitometry(software: Image J, NIH). Compared with vector group: **P<0.01(n=3). MMP: matrix metalloproteinase.

腫瘤的發生來自于體細胞突變后產生致癌基因或抑制了腫瘤抑制基因,它是一個多步驟的過程.腫瘤細胞的兩大特點是失控性的增殖和侵襲[10].Rap蛋白是一個小分子量GTP結合蛋白家族,與Ras原癌基因具大多數序列同源性[11].自從Rap家族被發現,人們將大多的注意力集中在Rap1蛋白.有研究結果顯示Rap1的異常活化能促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[12,13],且Rap1GAP能抑制細胞骨架的重構和甲狀腺癌細胞的運動[14].最近有報道[7]顯示Rap2蛋白與Rap1類似,也能調節細胞的粘附.Rap1GAP和Rap2共表達在正常的甲狀腺濾泡細胞.在正常的甲狀腺細胞中無Rap1表達,但是Rap1卻出現在乳頭狀甲狀腺癌中,而且甲狀腺癌中也發現了Rap2的高表達.這表明Rap活性的增強與腫瘤發生緊密相關.兩種Rap蛋白的出現提示當Rap1GAP下調后Rap1和Rap2都被活化.當低水平Rap1GAP瞬時表達,其能力可充分阻斷乳頭狀或未分化甲狀腺癌細胞株的內源性Rap2活性時,Rap1GAP可以減弱細胞遷移侵襲的能力[15].Dominissini等[16]也發現Rap2a和AMFR通過下調microRNA成為膠質瘤遷移和侵襲的主要調節者.Prabakaran等[17]發現從濾泡甲狀腺癌分離的侵襲性細胞Rap2a高表達.而且,有報道[18]顯示Rap2與腫瘤的形成及惡性轉變也有關,Rap2下游效應因子RPIP9在乳腺癌中活性升高,而且其活性與乳腺癌的惡性轉移程度密切相關.而Rap2另一下游效應因子MAP4K4在多種腫瘤組織中高表達,其活性程度與腫瘤的侵襲及轉移相關[19].但是,Bigler等[20]卻發現前列腺癌細胞中活化的Rap2a下降.綜上所述,Rap2a對腫瘤細胞的遷移能力是促進還是抑制作用目前還存在一定爭議,且其對肺癌細胞遷移能力的影響未見報道.

本實驗克隆得到了Rap2a基因的全長ORF區的真核表達質粒,通過轉染H1299和A549兩種肺癌細胞發現Rap2a蛋白成功表達于肺癌細胞.通過Transwell小室遷移實驗發現,Rap2a過表達后能引起肺癌細胞遷移能力增強,且作用效果明顯.MMP2是一種基質金屬蛋白酶,屬MMPs家族,幾乎能降解細胞外基質中各種蛋白,在腫瘤侵潤中發揮重要作用.明膠酶譜實驗結果顯示Rap2a過表達使細胞分泌MMP2的量隨之增加.這些結果提示Rap2a很可能成為新的候選癌基因.本研究將為后續研究Rap2a對腫瘤細胞的其它功能打下基礎,在后期研究中我們將致力于擴展Rap2a基因在肺癌細胞中的功能和機制研究及體外成瘤實驗,為肺癌的早期診斷和治療提供一定理論依據.