新城疫病毒V和W基因真核表達產物對DF-1細胞凋亡的影響

汪招雄,康銀峰，孫敏華，高詩敏，謝鵬，任濤

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)(農業部獸用疫苗重點創造實驗室，華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642)

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一種以呼吸道、消化道粘膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病，是危害養禽業最嚴重的傳染病之一。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國農業部將其列為一類傳染病[1]。

NDV屬于副粘病毒科副粘病毒亞科腮腺炎病毒屬有囊膜的負鏈RNA病毒。病毒基因組主要編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,L)、磷蛋白(phosphate protein,P)、血凝素神經氨酸酶(haem-agglutinin neuraminidase protein,HN)、細胞融合蛋白(fusion protein,F)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)和膜蛋白(matrix,M)等6種結構蛋白以及P基因編輯產生的2種非結構蛋白如V、W蛋白。NDV通過在其P基因第484位保守的編輯位點上插入一個鳥嘌呤核苷酸G致使閱讀框后移一位產生V基因,插入2個G則產生W基因，V、W蛋白與P蛋白具有共同的獨特的N末端區域和各自高度保守的C末端區域[2]。近年來的研究表明，NDV V蛋白具有增強病毒復制的作用，不同的NDV V蛋白因為其C-端氨基酸存在差異，導致了病毒復制的差異，毒力強的病毒V蛋白能明顯增強病毒的復制[3]。而目前對NDV W蛋白功能的研究較少。本研究旨在探討不同毒力的NDV V和W蛋白對細胞凋亡的影響，為這2種蛋白的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與試劑

pEGFP-N1由華南農業大學獸醫學院禽病實驗室保存，pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W由筆者自行構建，LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司，雞胚成纖維細胞(DF-1)由華南農業大學獸醫學院禽病實驗室保存。

1.2 質粒轉染

參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明將pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和空載體pEGFP-N1轉染DF-1細胞。設置不轉染質粒的空白對照組。

1.3 熒光顯微鏡下觀察 NDV V和W基因在DF-1細胞中真核表達產物

將質粒轉染DF-1 24h后，將細胞置于熒光倒置顯微鏡下，觀察GFP在細胞中的表達情況并拍照。

1.4 流式檢測細胞凋亡

在質粒轉染后24、36h和48h，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞。先后應用7-AAD和Annexin V-PE作用細胞，在反應1h內，用流式細胞儀檢測檢測細胞凋亡情況。使用未經處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。

2 結果與分析

2.1 NDV V和W基因真核表達產物在DF-1細胞中的表達情況

利用熒光倒置顯微鏡對各組轉染細胞進行觀察，在轉染后12h，可見pEGFP-La V 、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和pEGFP-N1質粒轉染的DF-1細胞發出綠色熒光，證明在轉染陽性細胞克隆中有融合蛋白的表達。隨著時間的推移，各組細胞熒光強度均有增強，圖1為轉染24h后各組細胞綠色熒光圖片。

圖1 轉染24h后融合蛋白La V-GFP、La W-GFP、GM V-GFP和GM W-GFP在DF-1細胞中的表達

2.2 流式檢測細胞凋亡情況

pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和空載體pEGFP-N1質粒分別轉染到DF-1 24、36h和48h后，收集各組細胞，用流式細胞儀檢測。早期凋亡以Annexin V-PE染色為主，在流式細胞分析圖(圖2)中為右下區(F4)細胞簇，晚期凋亡為Annexin V-PE/7-AAD雙染色，在流式細胞分析圖中為右上區(F2)細胞簇。

檢測結果表明，相對于空白細胞對照組，在質粒轉染后24、36h和48h，所有轉染組誘導的細胞凋亡均有明顯的提高，并且隨著轉染時間的增加，細胞早期凋亡率逐漸上升。在質粒轉染后24h，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表達產物誘導DF-1細胞的凋亡率在14.26%～17.09%之間，差異不大，但是都明顯高于空載體組。而在質粒轉染后36h，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表達產物誘導細胞凋亡率分別為45.05%和43.4%，明顯高于pEGFP-La V和pEGFP-La W誘導的31.44%和38.64%的凋亡率。在質粒轉染后48h，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表達產物誘導細胞凋亡率均超過50%，pEGFP-GM W真核表達產物誘導細胞凋亡率達到了43.4%，而pEGFP-La V真核表達產物誘導細胞凋亡率最低，為33.44%。結果表明，來源于不同毒力NDV毒株非結構蛋白 V和W均能誘導細胞的早期細胞凋亡，但是誘導細胞凋亡能力存在一定的差異(圖2和表1)。

圖2 NDV V和W基因真核表達產物對DF-1細胞凋亡影響(轉染48 h)

組別及轉染時間凋亡比例/%F1F2F3F4組別及轉染時間凋亡比例/%F1F2F3F4Blank-24h0.050.0299.170.76N1-24h1.780.0087.8010.42Blank-36h0.000.0096.713.29N1-36h6.850.0074.6218.53Blank-48h0.070.0097.332.60N1-48h14.000.0153.2432.75GM V-24h0.090.0085.6514.26La V-24h0.140.0184.2915.56GM V-36h0.060.0254.8745.05La V-36h0.120.1068.3431.44GM V-48h0.280.0152.9746.74La V-48h0.000.0066.5633.44GM W-24h0.160.0382.7217.09La W-24h0.260.0083.6416.10GM W-36h0.060.0256.5243.40La W-36h0.060.0361.2738.64GM W-48h0.210.0849.2050.51La W-48h0.290.0049.6550.06

注：1.Blank：正常細胞對照組；La V：pEGFP-La V質粒轉染組；La W：pEGFP-La W質粒轉染組；GM V：pEGFP-GM V質粒轉染組；GM W：pEGFP-GM W質粒轉染組；N1：空載體pEGFP-N1質粒轉染組。2． F1：機械損傷細胞；F2：晚期細胞凋亡；F3：正常細胞；F4：早期凋亡細胞組。

3 討論

機體正常的細胞凋亡對機體的正常發育和新陳代謝是必要的，有助于維持組織穩態，是宿主抵抗多種有害因素的一種有效防御機制。而病毒感染宿主細胞后，它需要利用宿主的物質和能量系統來完成病毒的復制過程。病毒感染后引起細胞凋亡,不利于病毒增殖而有利于病毒擴散;病毒進入細胞后表達的一些病毒蛋白將會引起細胞的凋亡過程。

近年來，很多學者對NDV誘導的細胞凋亡進行了廣泛的研究。房慧伶等[4]和李翔等[5]應用NDV標準強毒F48E8株感染雞，發現該毒株可以在體內誘導胸腺和法氏囊淋巴細胞凋亡,并認為由此所致的免疫抑制可能是NDV致病的重要原因。蔣麗娜等[6]用NDV感染體外培養S180肉瘤細胞發現，該病毒對S180細胞增殖有明顯抑制作用,可誘導S180細胞凋亡。崔玉東等[7]應用研究發現新NDVⅠ系毒株能通過Caspase依賴性途徑誘導雞胚成纖維細胞(CEF)凋亡,其中Caspase28和Caspase29在凋亡中發揮重要作用,而Caspase23和Caspase210在凋亡中不發揮作用。Ravindra等[8-11]也研究發現，NDV 感染能夠通過Caspase依賴性途徑誘導細胞凋亡誘導細胞，在感染NDV的Vero細胞中，感染24h的Caspase 8 活性高于感染48h的活性，而Caspase 9活性表現在這2個時間點正好相反，Caspase 3在這2個時間點活性都比較高。基于此，筆者認為NDV感染48h 后誘導細胞凋亡主要是通過外源性凋亡途徑。而且，病毒感染后增加Bax轉化Bcl-2率，p53和Caspase 3、8、9表達。將NDV HN蛋白作用CEF顯示，該蛋白能夠通過提高Caspase 1、9、8、3活性，減損線粒體膜潛能和增加細胞氧化應激能力來誘導細胞凋亡。

然而，還沒有發現NDVV和W蛋白誘導細胞凋亡的報道。在本研究中，將pEGFP-La V、 pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和pEGFP-N1質粒轉染DF-1細胞中后，在不同時間點分別檢測了各組DF-1細胞的凋亡情況，結果發現,NDV V和W基因的真核表達產物均能誘導很高比例的DF-1發生細胞凋亡。但是V和W蛋白是通過什么途徑對DF-1細胞細胞造成凋亡的，尚需進一步研究。

[參考文獻]

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[3]劉玉良,劉秀梵.新城疫病毒P基因的RNA編輯及其抗干擾素作用[J].動物醫學進展,2004,25(6):1-3.

[4]房慧伶,李翔,曾蕓,等.新城疫病毒F48E8體內誘導雞胸腺淋巴細胞凋亡的研究[J].畜牧與獸醫,2007,39(4):17-19.

[5]李翔,房慧伶,曾蕓,等.城疫病毒人工感染雞誘導胸腺和法氏囊細胞凋亡的初步研究[J].廣西畜牧獸醫，2005,21(2):51-53.

[6]蔣麗娜,孫黎,程建貞,等.新城疫病毒體外誘導S180細胞凋亡的實驗研究[J].河北北方學院學報,2008,25(3):11-14.

[7]崔玉東,冉旭華,宋佰芬,等.新城疫病毒Ⅰ系毒株通過Caspase途徑誘導雞胚成纖維細胞凋亡[J].中國獸醫學報,2006,26(3):254-256.

[8]Ravindra P V,Ashok K，Tiwari,et al.HN protein of Newcastle disease virus causes apoptosis in chicken embryo fibroblast cells [J].Arch Virol,2008,153:749-754.

[9]Ravindra P V,Ashok K，Tiwari,et al.Induction of apoptosis in Vero cells by Newcastle disease virus requires viral replication,de-novo protein synthesis and caspase activation[J].Virus Research,2008,133:285-290.

[10]Ravindra P V,Ashok K，Tiwari,et al.Newcastle disease virus-induced cytopathic effect in infected cells is caused by apoptosis[J].Virus Research,2009,141:13-20.

[11]Ravindra P V,Ashok K.Tiwari,et al.Time course of Newcastle disease virus-induced apoptotic pathways[J].Virus Research,2009,144:350-354.