響應面分析法優化濕地松松針中酪氨酸酶抑制劑提取工藝

季寅寅，江震宇，朱 晨，張佳艷，周珊珊，徐麗珊

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

酪氨酸酶是目前已知的生物體內合成黑色素的關鍵酶[1]，它與人體膚色以及雀斑、褐斑等黑色素過度沉積的疾病發生有關[2]。在黑色素細胞內，酪氨酸在酪氨酸酶作用下氧化為多巴、多巴醌，多巴醌經一系列的反應，最終合成黑色素[3]，因此，可以通過抑制酪氨酸酶活性阻斷黑色素合成。而植物源酪氨酸酶抑制劑在化妝品領域具有重要的應用價值[4-6]，熊果苷就是一種目前市場上廣泛使用的通過抑制酪氨酸酶活性以達到美白效果的植物源美白劑[7]。另外，研究表明，酪氨酸酶抑制劑可以防止果蔬褐化[8]，影響昆蟲的蛻皮[9]。

我國松屬資源豐富，南方地區種植了大面積的濕地松（Pinus elliottii Engelm.），形成了多個人工濕地松林區。濕地松具有良好的適應性和抗逆力，其松針是一種可持續的再生性資源，儲備量大，無毒，但目前還沒有得到很好的開發利用[10]。

本研究以濕地松松針為原料，優化酪氨酸酶抑制劑的提取工藝。研究結果可以為開發濕地松松針源酪氨酸酶抑制劑，并使其進一步應用于化妝品、食品和藥物領域提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 島津UV-2550紫外分光光度計（島津制作所）、水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）、DZF-6050B真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）、BPG-9070A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、CT 15RE日立臺式離心機、pH計。

1.1.2 主要試劑 酪氨酸酶（日本Wako公司）、L-酪氨酸（上海寶曼生物科技有限公司）、熊果苷（上海寶曼生物科技有限公司）。

1.1.3 試驗材料 供試材料為濕地松（Pinus elliottii Engelm.）松針。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶活性及抑制能力的測定 在酪氨酸酶催化反應生成黑色素的過程中，酪氨酸酶的催化反應主要發生在酪氨酸轉化為多巴以及多巴轉化為多巴醌這2個階段[11]。多巴醌是紅色物質，在一定波長下（475 nm）有最大吸收，可進行測定[12]，在一定范圍內，紅色的深淺與多巴醌含量的多少成正比，單位時間多巴醌的生成量可用來表示酪氨酸酶的活性。在相同條件下，加入抑制劑，以多巴醌的減少量表示對酪氨酸酶的抑制能力。

L-酪氨酸溶液、酶溶液均用0.2 mol/L，pH值為6.8的磷酸緩沖溶液配制。按表1準確吸取A，B，C，D組反應液，在37℃水浴中充分反應，6 min時于475 nm處測定吸光值A，按公式（1）計算抑制率。

表1 酪氨酸酶催化反應混合體系 μL

式中，A475B為底物與酪氨酸酶反應6 min時的吸光值；A475D為底物與酪氨酸酶在抑制劑存在下體系反應6 min時的吸光值。

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性成分提取的單因素試驗稱取一定量烘干的濕地松松針，按單因素試驗設計[13]（料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）、乙醇濃度（0，25%，50%，75%，100%）、浸提溫度（20，40，60，80，100 ℃）、浸提時間（0.5，1，2，3 h））進行提取，提取液經抽濾后定容至5 mg/mL（以濕地松松針的干質量計），測定其對酪氨酸酶活性的抑制能力。

1.2.3 響應曲面法試驗設計 以濕地松松針提取物對酪氨酸酶的抑制率為目標函數，根據單因素試驗的結果選取主要影響因素，采用Design-Expert 8.05b統計軟件中的Box-Benhnken（BBD）試驗設計法進行設計及數據分析[14-15]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

以濕地松松針為原料，考察料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間對提取液的酪氨酸酶抑制活性的影響（圖 1）。

由圖1可知，料液比、乙醇濃度、浸提溫度對濕地松松針中酪氨酸酶抑制成分提取的影響較為明顯，分別在料液比為1∶15、乙醇濃度為50%、提取溫度為80℃時抑制率達到最大。對乙醇濃度進行進一步細化試驗得知，乙醇濃度為60%時的抑制率大于50%時的抑制率。隨著浸提時間的延長，濕地松松針粗提物對酪氨酸酶的抑制作用增大，提取時間為1 h時的抑制率顯著高于0.5 h，而1，2 h間差異不顯著，為了提高效率，選擇的浸提時間為1 h。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 試驗結果與分析 根據單因素的試驗結果確定料液比、乙醇濃度和提取溫度為擬合因素。試驗擬合因素編碼以及水平[15]列于表2。

表2 試驗擬合因素編碼及水平

以濕地松松針提取物對酪氨酸酶活性的抑制率為評價指標，設計3因素3水平共17個試驗點，含4個中心點重復，得到結果如表3所示。

二次響應面回歸模型為：抑制率（%）＝61.95＋4.21×A－4.65×B＋15.57×C－1.85×A×B＋3.57×A×C－0.99×B×C＋2.05×A2－5.81×B2－22.83×C2。

方差分析結果列于表4。

表3 響應面試驗設計及結果

表4 響應面二次模型及其回歸系數的方差分析結果

從表4可以看出，3個因素對酪氨酸酶抑制率的影響都很顯著，影響程度從大到小依次為提取溫度、乙醇濃度、料液比；且響應回歸模型為極可信，試驗結果能與回歸方程良好地擬合，各擬合因素間并非簡單的線性關系。各試驗因素對響應值的相關系數 R2＝4 724.33/4 733.86＝0.998＞0.8，說明抑制率實際值與預測值之間具有較好的擬合度，因此，該模型可準確預測濕地松松針提取物對酪氨酸酶的抑制效果。

2.2.2 交互擬合因素效應分析 提取溫度、料液比、乙醇濃度3個因素之間的交互效應如圖2所示。

由圖2可知，當乙醇濃度為60%時，料液比與溫度對酪氨酸酶抑制率的交互影響作用不明顯；當料液比為1∶15時，乙醇濃度與溫度對酪氨酸酶抑制率的交互影響作用極顯著；當溫度為80℃時，料液比與乙醇濃度對酪氨酸酶抑制率的交互影響明顯。

2.2.3 驗證試驗 利用Design-Expert 8.05b軟件進行最優化分析，以濕地松松針提取物對酪氨酸酶的抑制率為指標，確定最佳提取條件為：料液比1∶18，乙醇濃度54.04%，溫度84.32℃，預測在此條件下，所得濕地松松針提取物對酪氨酸酶活性的抑制率為74.27%，提取物得率為21.43%。

考慮到實際情況，在驗證試驗中將最優提取條件調整為：料液比1∶18，乙醇濃度55%，浸提溫度85℃。驗證3次，測得濕地松松針提取物對酪氨酸酶的抑制率為70.67%±1.08%，與預測值間無顯著差異，表明采用該模型優化的工藝參數具有可行性。

2.3 濕地松松針粗提物的酪氨酸酶抑制活性

測定不同質量濃度濕地松松針提取物對酪氨酸酶的抑制率，且與陽性對照熊果苷進行比較，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著濕地松松針提取物、熊果苷質量濃度的增加，酪氨酸酶抑制率增加，二者的IC50值分別為 0.91，0.74 mg/mL。

3 結論

本研究通過單因素試驗及3因素3水平響應面法分析，得到響應值與各因素間的數學模型。根據模型可知，各因素對提取結果的影響大小順序為：提取溫度＞乙醇濃度＞料液比。確定濕地松松針中酪氨酸酶抑制劑提取的最佳工藝參數為：料液比1∶18，乙醇濃度55%，溫度85℃，提取液對酪氨酸酶的抑制率達70.67%。濕地松松針的提取物的得率為21.43%，對酪氨酸酶抑制率的IC50值為0.91 mg/mL。

本試驗利用響應面分析法優化濕地松松針酪氨酸酶抑制劑提取的提取工藝，可為開發濕地松松針源酪氨酸酶抑制劑，并將其進一步應用于化妝品、食品和藥物領域提供理論依據。

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