不同居群款冬種質資源SRAP遺傳多樣性分析

賀潤麗，平莉莉，王倫宇，楊 靜，郭慧青

（山西中醫學院，山西太原030024）

款冬花為常用中藥，是菊科款冬屬植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾，又名看燈花、西冬花、九九花等，味辛、甘，性溫，具潤肺下氣、止咳化痰之功效，可用于治療急、慢性支氣管炎及肺結核、咳嗽、咳吐膿血等癥[1]。現代藥理研究表明，款冬花有明顯的止咳、袪痰、平喘、升壓和抗炎等作用[1]。國內外已對款冬花的活性成分、藥理作用、栽培等方面進行了大量的研究報道[2-9]，但有關從分子水平上研究款冬資源的遺傳多樣性目前尚未見報道。

隨著臨床用藥的增大和自然環境的惡化，款冬野生資源日益枯竭，目前市場上銷售的款冬花藥材以栽培品為主，且主產于甘肅、陜西、山西、四川等地[2-3，9]?？疃ㄔ耘嘁愿o進行無性繁殖，品質逐年下降，由于對其遺傳背景、親緣關系缺乏深入系統的研究，致使育種工作受到很大限制，急需從分子水平上研究我國款冬資源的遺傳多樣性。

本研究利用SRAP技術，對16個來自于不同地區野生和栽培的款冬種質資源進行分析，旨在從分子水平探討款冬的遺傳差異，為可持續利用和保護種質資源、選育優質高產的品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

于2012年10—11月款冬花蕾采收期采樣，采集到山西省11個縣區的野生居群11份以及甘肅、河北、內蒙古的野生和栽培居群5份，共計16份種質資源，將采集的材料潔凈后硅膠快速干燥葉片帶回實驗室，各居群的采集信息列于表1。供試材料均由山西中醫學院裴香萍副教授鑒定，為菊科款冬屬植物款冬（Tussilago farfara L.）。

表1 樣品編號及來源

1.2 試驗儀器和試劑

1.2.1 儀器 1-14型臺式離心機（北京賽多利斯儀器系統有限公司），3K30恒溫水浴鍋（上海申騰生物技術有限公司），BIOPHOMETER核酸測定儀（EPPENDORF，德國），PTC-200 PCR儀（M.J.RESEARCH，USA），DYY-Ⅲ5電泳儀和 DYCZ-30C電泳槽（北京市六一儀器廠），BIO-RAD凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2.2 試劑 丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、37%甲醛、TEMED、硝酸銀、β-巰基乙醇、瓊脂糖、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、Taq 酶、DNA Marker及 dNTPs等，均購自TaKaRa公司；SRAP引物于上海生工生物工程有限公司合成；NaCl，KAc等試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 每個居群取20個單株的葉片等量混合，采用改進的CTAB提取法[10]提取葉片總DNA，存放于-20℃冰箱備用。

1.3.2 引物設計與篩選 參照Li等[11]發表的引物，設計了9個上游引物（ME1～ME9）和11個下游引物（EM1～EM11），如表2所示。

1.3.3 SRAP反應及電泳分析檢測 SRAP-PCR反應體系為20μL，包括模板DNA 100 ng，10×PCR buffer 2.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6μL，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1 U，用超純水補足至20μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性 1 min，50℃復性 1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物加入6.0μL 6×loadingbuffer，8%非變性丙烯酰胺凝膠檢測，電泳緩沖液為1×TBE，穩壓200 V，電泳至二甲苯青到凝膠底部時結束。采用硝酸銀染色觀察結果，染色后掃描儀掃描、記錄。

表 2 SRAP 引物序列（5′→ 3′）

1.4 數據統計

根據擴增產物電泳圖譜，僅統計100～2 000 bp之間有差異、易于識別的多態性條帶，在相同遷移位置有條帶的記為1，無條帶的記為0，形成0，1矩陣，建立數據表格。

利用NTsys 2.10e分析軟件、SM法計算遺傳相似系數（GS），對結果以非加權算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 居群的多態性條帶比率分析

表3 篩選的多態性引物及擴增結果

從表3可以看出，從99對引物中篩選出擴增產物條帶信號強、重復性好、特征性好的11對引物。用11對引物組合對1個居群的款冬材料進行擴增，得到121條DNA條帶，其中，多態性條帶79條，多態性比率為65.3%，平均產生多態性條帶7.2條，多態性比率在36.4%～100%之間。其中，引物組合ME9-EM5的SRAP擴增反應圖譜如圖1所示。

2.2 不同居群的遺傳相似系數與聚類結果分析

根據11對引物組合的SRAP擴增數據，用NTsys 2.10e軟件計算各個種質資源的遺傳相似系數，結果（表4）表明，不同居群款冬樣品間的相似系數變化范圍為0.342～0.810，均值為0.587，表明供試材料多態性高、遺傳變異豐富。其中，山西廣靈款冬野生居群和河北蔚縣栽培居群的相似系數最高，為0.810，表明二者親緣關系最近；而山西廣靈野生居群和甘肅天水秦州栽培居群的相似系數最小，為0.342，表明二者親緣關系最遠。

表4 16個居群的遺傳相似系數

由圖2可知，以遺傳相似系數0.614為閾值，將各居群款冬分成五大類群，第Ⅰ類群以山西廣靈野生居群和河北蔚縣栽培居群聚在一起后，與內蒙古興和的栽培居群、婁煩的野生居群聚在一起；第Ⅱ類群以山西興縣的野生居群單獨成為一支；第Ⅲ類群包含了山西寧武、臨縣、太原天龍山、榆社、和順、中陽、沁源7個野生居群，其中又可分為4個小分支；第Ⅳ類群以甘肅甘谷的野生居群單獨成為一支；第Ⅴ類群以甘肅天水秦州區和隴西的栽培居群與山西夏縣的野生居群聚在一起。

3 討論

SRAP引物具有通用性，無需知道基因組信息，正反向引物兩兩搭配，降低引物合成成本[12-15]。本研究采用SRAP標記技術對不同居群款冬的遺傳基礎進行分析，顯示了一定的優越性和可行性，且擴增條帶較多，易辨別，重復性好，操作簡單。

用篩選到的11對SRAP引物對16個野生和栽培款冬居群的基因組DNA進行擴增，得到清晰條帶121條，其中，多態性條帶79條，多態性比率為65.3%。統計結果顯示，供試材料間的相似系數均值較小，說明所選材料遺傳多樣性較高，各居群款冬之間存在一定的遺傳差異。

聚類分析表明，16個居群的款冬可分為五大類群，各居群并不是按地理界限嚴格地聚在一起，但與地理分布和栽培歷史有一定的相關性[16-17]，如山西廣靈、河北蔚縣、內蒙古興和有栽培款冬的歷史，雖然在廣靈采集的是野生居群，但與內蒙古、河北的栽培居群聚在一起，甘肅隴西和天水的2個栽培居群也聚在一起，這可能與這些地區互相引種有關。因為栽培款冬依靠根莖進行無性繁殖，目前生產上尚無一定品種，主要依靠從野生款冬挖取根莖進行繁殖，或者各栽培地之間相互引進種根進行種植。山西興縣與甘肅甘谷的野生居群各單獨聚為一分支，雖然從形態上看，二者比較相似，表現為花蕾淺紅色，植株纖細，但由于地理位置相距較遠，各單獨聚為一支。山西的大部分野生款冬居群聚在一起，內部又分為4個小分支，說明山西野生款冬居群遺傳基礎變異豐富。

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