Cajal間質細胞在胃癌胃腸動力障礙中作用的實驗研究

胡俊華，王 琦，盧光新，楊艷果

湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科，湖北 十堰 442000

胃癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，發病率居第2位，死亡率仍居各種惡性腫瘤之首，每年約有934000例新發病例，其中約42%在中國［1］。臨床上發現大部分被診斷為胃癌的患者均有餐后上腹飽脹不適、間斷性上腹痛、反酸、噯氣、惡心、嘔吐等消化道梗阻癥狀，但影像學檢查未發現腸道梗阻的證據，僅提示胃腸動力下降。這些癥狀僅用腫瘤的發展不能完全解釋。

胃腸 Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是分布在胃腸道內由中胚層間充質細胞分化而來的一類細胞，被證實是胃腸道平滑肌的起搏細胞，以細胞網的形式分布于整個胃腸道，產生自發性電慢波，參與神經信號傳遞，調控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動，在胃腸道動力產生和傳導中具有重要作用［2］。大量實驗研究發現，ICC的減少及分布異常與人類很多胃腸動力障礙有關［3］。本研究通過胃癌大鼠模型，觀察胃癌大鼠幽門環形肌和下食管括約肌(lower esophageal sphincter，LES)肌條收縮功能的變化，ICC在胃體和胃竇變化，探索ICC與胃癌胃腸動力障礙的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組 裸鼠20只(湖北省實驗動物研究中心提供)2個月齡，雌雄不拘，體質量16～20 g，隨機分為正常對照組、胃癌組，每組10只。

1.2 細胞株及細胞培養 人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901，來自湖北醫藥學院附屬人民醫院中心實驗室。SGC-7901細胞吸盡上清液，PBS液洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5 ml，放置37℃恒溫水浴箱中5 min，振蕩后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，搖勻后分瓶，放入5%CO2細胞培養箱中孵育。倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，長滿瓶底后如上法分瓶孵育，直至所需的細胞數。取清潔血球計數板、蓋玻片，用0.4%臺盼藍染液與細胞懸液混勻，從蓋玻片一側計數板凹槽加入，于低倍倒置顯微鏡下觀察計數四角大分格中的細胞數。

1.3 動物模型的制作 將人胃癌SGC-7901細胞用0.2%胰酶消化成細胞懸液，無血清RPMI-1640培養基調整細胞濃度至1.0×106個/ml，臺盼藍染色記數活細胞＞95%。用1.0 ml微量注射器將0.2 ml細胞懸液皮下接種于胃癌組裸鼠右側背部，每只接種0.2 ml。當接種部位腫瘤長至最大徑4～5 mm時確定造模成功。

1.4 胃肌條張力變化 實驗時迅速敲擊裸鼠頭部致暈，剖腹取胃，沿胃小彎剪開胃腔，沖洗胃腔。切取幽門環形肌和下食管括約肌肌條各一條(長10 mm，寬2 mm)，置于盛有Krebs液的平皿中，仔細剝離黏膜層后，在Krebs液(37℃)的肌槽中恒溫孵育，肌槽底部持續通入95%O2和5%CO2的混合氣體。肌條一端用1號絲線固定在肌槽底部的有機玻璃彎鉤上，另一端固定在連于多導生理記錄儀的張力傳感器上，肌條與張力換能器相連，溫育1 h，給張力換能器1 g的前負荷。張力換能器輸入生理記錄儀，記錄肌條的機械收縮運動。

1.5 ICC的檢測 處死裸鼠，分離胃體組織，置10%中性甲醛固定，常規石蠟固定并切片。經恒溫箱60℃烘烤脫蠟和常規水化，經0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液pH(6.0 ±0.1)微波熱修復，PBS 洗 5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min，加入一抗c-kit抗體(兔IgG)37℃溫育1 h，PBS洗3次，5 min/次，加入酶標記二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)，37℃ 30 min，DAB顯色試劑盒顯色。每張切片光鏡下(400×)隨機選10個視野，計數棕黃色的梭形、多角形和不規則形細胞數目，每張切片測量3次，取均值，進行統計學處理。

1.6 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件包進行分析和處理數據，所有數據均采用均數±標準差表示，同組用藥前后電活動的比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(sNK法)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠離體幽門環形肌條及LES肌條收縮功能的測定 給張力換能器1 g的前負荷，幽門環形肌機械收縮運動記錄結果顯示，胃癌組幽門環形肌條及LES肌條肌肉張力和收縮振幅明顯降低，差異有統計學意義(P ＜0.01，見表1)。

表1 裸鼠離體幽門環形肌條及LES肌條的運動測定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

表1 裸鼠離體幽門環形肌條及LES肌條的運動測定()Tab 1 The motility of pylorus muscles and lower esophageal sphincter muscle on nude mice()

注:與正常對照組比較，*P ＜0.01。

2.2 裸鼠胃體ICC的變化 免疫組化染色顯示正常對照組胃竇和胃體部Kit陽性細胞(棕黃色顆粒)密集地分布在環形肌層和縱形肌層之間，主要是在環形肌層內及其附近，肌間神經叢中也有密集的ICC分布，胃底肌間神經叢未見ICC分布。胃癌組Kit陽性細胞非常稀疏地分布在環形、縱形肌層間，而且無環形肌層內及附近主要分布的特點，分布密度明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。胃癌組數目與正常對照組相比明顯減少，且形態異常，突起減少，并變短、變鈍。

表2 兩組ICC免疫組化半定量測定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

表2 兩組ICC免疫組化半定量測定 ()Tab 2 Immunohistochemistry results of interstitial cells of Cajal(ICC)()

注:與正常對照組相比，*P ＜0.01。

分組 例數 胃體 胃竇正常對照組10 33.46 ±3.12 21.23 ±3.21胃癌組 10 7.68 ±2.15* 12.23 ±3.54*

圖1 裸鼠胃體ICC的c-kit免疫組織化學染色(60×)A:正常對照組;B:胃癌組Fig 1 c-kit immunohistochemistry staining of ICC in nude mice(60×) A:nomal control group;B:gastric cancer group

3 討論

ICC是胃腸道平滑肌的起搏細胞，以細胞網的形式分布于整個胃腸道，產生自發性電慢波、參與神經信號傳遞，調控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動［4］。研究發現先天性巨結腸患兒病變段結腸壁內三種亞型的ICC數量均明顯減少甚至缺失，病變腸管喪失產生電慢波的能力，同時也有神經節細胞的減少共同導致了胃腸道動力紊亂。此外，還有很多消化道功能障礙性疾病也都存在ICC缺乏或減少，如慢性假性梗阻、賁門失遲緩癥、幽門狹窄、結腸蠕動緩慢、肛門括約肌失弛緩癥、輸入腸管癥候群、糖尿病腸功能障礙、慢傳輸型便秘及部分性腸梗阻、手術腸切除、空腸炎等均會引起ICC網絡紊亂和胃腸運動異常。因此，ICC的分布異常及功能缺失是很多胃腸功能紊亂的病理、生理學基礎。臨床上大多數胃癌患者均表現為上腹部疼痛外，可伴有反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐等消化道梗阻癥狀。因此，我們推測ICC在胃癌胃腸動力紊亂病理、生理機制中起著一定作用。

本實驗結果提示，胃癌組離體幽門環形肌條及LES肌條機械收縮波的振幅和頻率都較正常組明顯減少，表明發生胃腸動力障礙的胃癌大鼠胃機械收縮活動比正常對照組減弱，與我們臨床觀察到的患者早飽、惡心嘔吐、胃潴留等胃排空減弱的現象一致。

本研究中，組織切片c-kit免疫組化染色顯示，胃癌模型組大鼠胃體的ICC數目明顯減少，細胞突觸減少。它的減少可導致胃腸神經系統與平滑肌間的信息傳遞障礙，從而導致平滑肌收縮能力下降;ICC數目明顯減少，更會影響胃慢波的產生，使胃電節律紊亂，引起食管、胃蠕動緩慢，動力障礙。由此可見，胃癌ICC的異常改變與出現胃腸運動功能障礙有密切聯系。

總而言之，胃癌患者出現胃腸運動功能障礙，ICC的異常改變是其重要原因之一。保持ICC的數量和功能，延遲ICC信號網絡的破壞將有助于提高胃癌患者的生存質量。對ICC的研究將有助于找到一種輔助療法，值得進一步研究。

［1］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］Takaki M.Gut pacemaker cells:the interstitial cells of Cajal(ICC)［J］.J Smooth Muscle Res，2003，39(5):137-161.

［3］Wang XY，Huizinga JD，Diamond J，et al.Loss of intramuscular and submuscular interstitial cells of Cajal and associated enteric nerves is related to decreased gastric emptying in streptozotocin-induced diabetes［J］.Neurogastroenterol Motil，2009，21(10):1095-e92.

［4］Ward SM，Sanders KM.Interstitial cells of Cajal:primary targets of enteric motor innervation［J］.Anat Rec，2001，262(1):125-135.